第一節 顯微鏡檢查
微生物細胞含大量水分（一般在80%~90%以上），絕大多數必須染色，才能顯微鏡觀察。
一、染色
（一）染色的基本原理
借助物理因素和化學因素的作用進行
物理因素：細胞及細胞物質對染料的毛細現象、滲透和吸附作用
化學因素：細胞物質和染料的不同性質發生各種化學反應
細菌的等電點較低，pH在2~5之間，故在中性、堿性、弱酸性溶液中，<u>菌體蛋白質</u>電離后帶負電荷；而堿性染料電離時<u>染料離子</u>帶正電。
所以，細菌學上常用堿性染料染色。
染色操作程序：<u>制片→固定→媒染→染色→脫色→復染→水洗→干燥→鏡檢</u>
（二）染色方法
- 單染色法 一種染料、但不能鑒別微生物
- 復染色法 兩種or兩種以上、協助鑒別微生物。亦稱鑒別染色法。
- 單染色法
一種染色劑、簡便易行、適于形態觀察。
常用堿性染料。使用酸性染料時、必須降低染液的pH，使其呈現強酸性（低于菌體等電點），讓菌體帶正電荷、才易于染色。
- 石炭酸復紅染色液：著色快、時間短、菌體紅色
- 美藍染色液：著色慢、時間長、效果清晰、菌體藍色
- 草酸銨結晶染色液：染色迅速、著色深、菌體紫色
- 革蘭染色法
廣泛使用的鑒別染色法、1884丹麥Gram創立。
堿性染料（草酸銨）結晶紫染色、碘液媒染、<u>95%酒精</u>脫色、堿性番紅 復染。
初染、媒染、脫色、復染四個步驟。（G+菌體紫色、G-紅色）
- G+：有芽孢的桿菌、多數球菌、放線菌、真菌
- G-：弧菌、螺旋體、多數致病性無芽孢桿菌
主要依據：
- G+含有<u>核蛋白質鎂鹽與多糖的復合物、與碘和結晶紫的復合物結合很牢、不易脫色。</u>
- G+菌體<u>等電點比G-低</u>，相同pH下染色、<u>吸附堿性染料很多，因此不易脫去</u>。
- 兩類菌細胞壁對<u>結晶紫-碘復合物的通透性</u>也不一致，G+透性小，故不易被脫色。
- 抗酸染色法
<u>分枝桿菌屬、細胞壁含大量脂質</u>。
著色后抵抗強脫色劑鹽酸乙醇的脫色，又稱<u>抗酸桿菌（acid-fast bacilli）</u>
分枝桿菌-紅色、其他細菌&背景-藍色 - <u>5%石炭酸復紅染色劑</u>蓋滿痰膜，微火加溫→蒸汽，去火焰，<u>染色5~10分鐘</u>，水洗
- 加<u>5%鹽酸酒精脫色劑</u>蓋滿痰膜，<u>脫色3~5分鐘</u>，至無紅色、水洗
- 加<u>美藍復染劑</u>、（直接涂片30秒、集菌涂片1~3分鐘）、水洗、干后鏡檢。
- 芽孢染色
<u>孔雀綠 加熱條件下</u>染色，染料不僅進入菌體也可進入芽孢內，進入菌體的染料水洗后脫色、進入芽孢的染料很難被水洗脫色，復染劑染色后、芽孢保留初染劑顏色、菌體和芽孢囊被染成復染劑顏色。
芽孢染色操作步驟
制成菌懸液→<u>孔雀綠染色1分鐘</u>→試管水浴<u>加熱1520分鐘</u>→接種環取加熱染色菌液涂片→干燥→固定→<u>水洗**脫色**</u>→<u>**番紅或稀釋石炭酸復紅**復染12分鐘</u>→水洗→晾干→油鏡觀察 - 莢膜染色
采用負染色法染莢膜、濕墨水法（較簡便、適用廣）
莢膜不著色、在菌體周圍呈一透明圈。
由于莢膜含水量在90%以上，染色時不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。 - 負染色法
- 制片：載玻片、蒸餾水1滴、少量菌體混勻涂布
- 干燥：晾干or電吹風冷風吹干
- 染色：復紅染色液染色2~3分鐘
- 水洗
- 干燥
- 涂黑素：一小滴黑素、推片向右一拖、使黑素在染色涂面上成為一薄層、風干
- 鏡檢：先低倍鏡→再高倍鏡
背景灰色、菌體紅色、莢膜無色透明。
- 濕墨水法
- 制菌液：加一滴墨水、少量菌體混合
- 加蓋玻片：放一蓋玻片于混合液上、在蓋玻片上放一張濾紙、輕壓 吸去多余菌液
- 鏡檢
背景灰色、菌體較暗、在其周圍呈現一明亮的透明圈即為莢膜。
- 鞭毛染色
基本原理：染色前先用媒染劑處理、讓它沉積在鞭毛上、使鞭毛直徑加粗、然后再染色。常用<u>鍍銀法染色</u>。
步驟-簡略：
- 媒染(A)液：飽和硫酸鋁鉀、5%FeCl3、黑色溶液
- 媒染(B)液：5%AgNO3
制片：1滴蒸餾水、少許菌苔、平放干燥
染色：A液染35分鐘→蒸餾水沖洗→殘水瀝干or用B液沖去殘水（**充分洗凈A液、否則背景很臟**）→滴加B液→酒精燈上稍加熱、微冒蒸汽而不干、3060秒→蒸餾水沖洗、自然干燥
鏡檢：菌體深褐色、鞭毛為褐色
二、顯微鏡檢查
（一）普通光學顯微鏡
油浸物鏡、觀察完畢、<u>先用擦鏡紙</u>擦去鏡頭上的油、在用擦鏡紙蘸少許乙醚乙醇混合液（乙醚2份、無水乙醇3份）or二甲苯，擦去殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2~3下（朝一個方向）
普通光學顯微鏡<u>不能觀察細胞和細菌的亞結構。</u>
（二）暗視野顯微鏡（未染色活細胞、運動、不能細微結構）
設計原理：丁達爾現象
光源的中央光束被阻擋、散射的光線投入物鏡、整個視野是黑暗的。
暗視野中觀察到的是被檢物體的衍射光圖像、并非物體本身、所以只能看到物體的存在和運動，（不能辨清物體的細微結構）。用于→未染色標本的<u>活的</u>細菌、真菌，并可觀察活細胞內的線粒體及細菌鞭毛的運動。觀察螺旋體時多用暗視野顯微鏡。
暗視野聚光器→顯微鏡的聚光器支架上、顯微鏡燈照明，聚光器和標本片之間要加一滴<u>香柏油</u>。目的：避免聚光鏡全反射。
（三）相差顯微鏡（活細胞、細微結構）
將光線通過透明標本細節產生的光程差（相位差）轉化為光強差的特種顯微鏡。
適用于對<u>活體細胞生活狀態下的生長、運動、增殖情況及細微結構</u>的觀察。
放上綠色濾光片
（四）熒光顯微鏡
高發光效率的點光源→濾色系統→一定波長的光<u>（紫外光365nm、紫藍光420nm）作為激發光</u>→激發標本內的熒光物質發射出熒光。
敏感性高、用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究。
熒光光源一般采用超高壓汞燈（50~200W）、激發濾片（紫外、紫色、藍色、綠色）、阻斷（或壓制）濾光片
按光路區分
- 透射式熒光顯微鏡 激發光源通過聚光鏡、穿過標本、放大倍數↑熒光↓
- 落射式熒光顯微鏡 激發光從物鏡落射到標本表面、放大倍數↑熒光↑
第二節 病原細菌分離
一、傳統細菌分離方法
傳統細菌：指人工培養基上易于增殖的細菌
（一）標本的分離前處理
- 增菌
- 冷增菌 耶爾森-低溫下不停止繁殖、4℃
- 加熱 芽孢桿菌耐熱-炭疽芽孢桿菌、沸水浴15 mins
（二）平板劃線分離技術
“三段劃線”、目的：使細菌分散、生長為單個菌落、便于挑選目標細菌
（三）分離培養基選擇
- 高營養培養基or敏感培養基
目的：為目標細菌提供盡可能完整的營養條件、促進繁殖
氨基酸、糖類、無機鹽類、補充營養物質 - 鑒別培養基
常用鑒別物質： - 染料
- 特殊的糖、醇類物質加酸堿指示劑
- 顯示目標細菌特殊代謝產物的化學反應試劑
- 選擇培養基
充分支持目標細菌生長、盡可能抑制雜菌、特別是限制呈“匐行性”生長的雜菌（變形桿菌、真菌）
選擇手段： - 限制培養基中的營養成分、采用特殊生長條件：對營養要求低、條件特殊的致病菌。（霍亂弧菌--堿性蛋白胨培養基）
- 加入抑菌成分：龍膽紫、膽鹽等
- 加入抗生素：多粘菌素、兩性霉素B、制霉菌素
（四）菌落識別與挑取
- 菌落的肉眼形態
炭疽--灰白色、磨砂玻璃狀；鼠疫：生長慢、灰黃色、隆起 - 細菌的顯微形態
**炭疽：獅鬃樣菌落；鼠疫：表面粗糙的顆粒狀突起、血瓊脂平板-邊緣帶有“花邊”；支原體--“荷包蛋”狀 - 挑取菌落
第二次純分/進一步培養鑒定
二、難培養細菌的分離
類型：
- 營養要求高，或需特定成分（如支原體）
- 需要特殊溫度、濕度、pH和氣體條件
- 生長特別緩慢、培養過程中防止雜菌污染和過度生長難度較大
（一）厭氧菌分離
燭缸、嚴格的分離操作-處理標本開始無氧的手套箱
（二）支原體分離
使用特殊的培養基：添加膽固醇、馬血清、酵母提取物、抗生素等。液體-添加酚紅指示劑
固體培養基、5%CO2、37℃、7日后用60倍低倍鏡 斜投射光觀察是否生長、一般3周左右長成菌落。菌落中心陷入平皿生長、“油煎蛋”樣
支原體菌落堅實、無法挑取、滅菌刀片切取菌落瓊脂塊→移入液體培養基→棕紅色變為黃綠色提示生長、支原體小→液體培養不會明顯渾濁
反復2~3次。
（三）L型分離
L型→細胞壁缺損的細菌
在普通滲透壓下、細胞壁缺損的細菌會“漲破”死亡→分離L型的培養基必須高滲透壓。
<u>瓊脂濃度0.5%（0.30.5%半固體、1.5%2.5%固體）以下的半固體培養基，加馬血清及10%蔗糖維持滲透壓</u>（3%~5%NaCL？）L型可生長成“油煎蛋”樣細小菌落。
（四）螺旋體分離
- 鉤端螺旋體
血液標本→<u>Korthof或EMJH培養管、2030℃→57 d取培養物</u>暗視野顯微鏡下觀察有無生長
克服雜菌污染，病人尿液、采集前一晚服用<u>碳酸氫鈉（NaHCO3）2~4g，培養基中加入5-氟尿嘧啶or磺胺嘧啶</u> - 梅毒螺旋體
接種<u>兔睪丸or眼前房。氧濃度1.5%、含有棉尾兔上皮細胞的組織培養基、34~35℃</u>。
（五）立克次體分離
專性細胞內寄生菌、必須動物及細胞分離
姬姆尼茨、吉姆薩染色
- 通過動物分離
除<u>恙蟲病選小白鼠、其他立克次體雄性豚鼠</u>。 - 使用雞胚分離
<u>5~7日齡雞胚、卵黃囊</u> - 細胞培養
<u>Vero、L929細胞</u>、37℃、5%CO2
三、使用動物的分離方法
常用動物：小鼠、大鼠、豚鼠
注射：皮下、腹腔、靜脈or特殊器官（如顱內接種）
已分離的病原菌在保存過程中突變→喪失致病能力→制成懸液<u>接種于動物→重新從動物分離出來→成為完整毒力的培養物</u>，過去是保存病原菌的常規做法→菌株的“復壯”（實際上是利用動物的疾病過程，將殘留的具有毒力的致病細菌從大量無毒力的突變細菌中重新分離出來）
第三節 病原細菌鑒定
一、生化特征鑒定方法
二、特殊反應鑒定方法
最常用-革蘭染色、特殊反應-莢膜腫脹試驗等
三、噬菌體鑒定方法
霍亂弧菌鑒定：噬菌體-生物學分型
四、其他特殊的鑒定方法
單克隆抗體檢測特異性抗原：凝集試驗、ELISA、免疫熒光試驗、膠體金免疫吸附試驗等
五、分型
最常用實驗同四
六、特異性核酸片段鑒定
比抗原檢測敏感性更高
- 聚合酶鏈式反應→PCR：普通PCR、套式PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR
- 探針雜交
- 基因芯片雜交
七、病原毒力測定
通常使用動物試驗。半數致死量為指標。
第四節 分離后細菌的培養和保存
一、純分后細菌的培養方法
每一次分離過程、獲得的純培養物→稱作一“株”該種細菌
所保存的培養物→稱為該種細菌的“菌種”。
將細菌增殖到所需數量→這一過程稱為“培養”。
- 細菌數量不大時，固體or半固體培養基
- 用于遺傳學鑒定：特別強調從單獨菌落開始，固體的平板培養基
- 一般的細菌鑒定：常用斜面。
- 短期保存培養物：高層？？半固體培養基→試管→接種針穿刺到瓊脂培養基內。不容易干燥、不容易污染
- 提取細菌成分，需要較大培養量
- 固體培養基、<u>在“茄瓶”or“克氏瓶”中進行、一種放大了的斜面。</u>
- 液體培養基、燒瓶中振蕩培養、需氧細菌使用較大燒瓶、<u>培養基只占燒瓶容量的10%~15%</u>，氣體充分交換。
- 大量培養、使用“發酵罐”：一定容積的培養液、最大數量的細菌
恒溫加熱、配有加液口、攪拌器、通氣管道
二、菌種保存方式
早期--傳代
-
目前--多數采取“凍干”，<u>至少保持20年</u>。穩定劑：脫脂乳or蔗糖
缺點- 一支只能使用1次
- 凍干的菌種，必須經過“復蘇”。（第一次培養時總是生長不良，至少一次傳代）
-
低溫保存 穩定劑：甘油
<u>不可使解凍、幾乎永久性保持、即作保存菌株又作工作菌種</u>- -20℃ 緩沖液加甘油60%濃度、呈黏稠的液體狀，常規挑取
- -80℃ 加15%~20%甘油、凍結成硬冰激凌狀、竹簽刮取冰屑
