Aaron T. L. Lun1, Davis J. McCarthy2,3 and John C. Marioni1,2,4
1Cancer Research UK Cambridge Institute, Li Ka Shing Centre, Robinson Way, Cambridge CB2 0RE, United Kingdom
2EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, United Kingdom
3St Vincent's Institute of Medical Research, 41 Victoria Parade, Fitzroy, Victoria 3065, Australia
4Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SA, United Kingdom
2019-05-03
簡介
在這個工作流程中，我們檢查了來自小鼠大腦細胞類型研究的異構數據集(Zeisel et al. 2015)。這包括大約3000個不同類型的細胞，如少突膠質細胞、小膠質細胞和神經元。使用Fluidigm C1微流體系統(2014年)分離單個細胞，使用基于umi的方案對每個細胞進行文庫制備。測序后，通過計算每個基因的UMIs數目來量化表達。所有內源性基因、線粒體基因和spikein轉錄本的計數數據（ count data ）可從http://linnarssonlab.org/cortex獲得。
library(BiocFileCache)
bfc <- BiocFileCache("raw_data", ask = FALSE)
base.url <- file.path("https://storage.googleapis.com",
"linnarsson-lab-www-blobs/blobs/cortex")
mRNA.path <- bfcrpath(bfc, file.path(base.url,
"expression_mRNA_17-Aug-2014.txt"))
mito.path <- bfcrpath(bfc, file.path(base.url,
"expression_mito_17-Aug-2014.txt"))
spike.path <- bfcrpath(bfc, file.path(base.url,
"expression_spikes_17-Aug-2014.txt"))
格式化數據
計數數據分布在多個文件中，因此需要進行一些工作來將它們合并到單個矩陣中。我們定義了一個簡單的實用函數，用于從每個文件加載數據。(我們強調此函數僅與當前數據集相關，不應用于其他數據集。如果所有的計數都在一個單獨的文件中，并且與元數據分離，則通常不需要這種工作。
readFormat <- function(infile) {
# First column is empty.
metadata <- read.delim(infile, stringsAsFactors=FALSE, header=FALSE, nrow=10)[,-1]
rownames(metadata) <- metadata[,1]
metadata <- metadata[,-1]
metadata <- as.data.frame(t(metadata))
# First column after row names is some useless filler.
counts <- read.delim(infile, stringsAsFactors=FALSE,
header=FALSE, row.names=1, skip=11)[,-1]
counts <- as.matrix(counts)
return(list(metadata=metadata, counts=counts))
}
利用這個函數，我們讀取內源性基因、ERCC spik -in轉錄本和線粒體基因的計數。
endo.data <- readFormat(mRNA.path)
spike.data <- readFormat(spike.path)
mito.data <- readFormat(mito.path)
我們還需要重新排列線粒體數據的列，因為順序與其他文件不一致。
m <- match(endo.data$metadata$cell_id, mito.data$metadata$cell_id)
mito.data$metadata <- mito.data$metadata[m,]
mito.data$counts <- mito.data$counts[,m]
在這個特定的數據集中，一些基因由多個行表示，這些行對應于可選的基因組位置。為了便于解釋，我們將與單個基因對應的所有行計數相加。
raw.names <- sub("_loc[0-9]+$", "", rownames(endo.data$counts))
new.counts <- rowsum(endo.data$counts, group=raw.names, reorder=FALSE)
endo.data$counts <- new.counts
然后這些計數被合并成一個單獨的矩陣來構建一個單獨的SingleCellExperiment對象。為了方便起見，所有cell的元數據都存儲在同一個對象中，供以后訪問。
library(SingleCellExperiment)
all.counts <- rbind(endo.data$counts, mito.data$counts, spike.data$counts)
sce <- SingleCellExperiment(list(counts=all.counts), colData=endo.data$metadata)
dim(sce)
我們添加了基于基因的注釋來標識對應于每一類特性的行。我們還將為每一行確定Ensembl標識符。
# Specifying the nature of each row.
nrows <- c(nrow(endo.data$counts), nrow(mito.data$counts), nrow(spike.data$counts))
is.spike <- rep(c(FALSE, FALSE, TRUE), nrows)
is.mito <- rep(c(FALSE, TRUE, FALSE), nrows)
isSpike(sce, "Spike") <- is.spike
# Adding Ensembl IDs.
library(org.Mm.eg.db)
ensembl <- mapIds(org.Mm.eg.db, keys=rownames(sce), keytype="SYMBOL", column="ENSEMBL")
rowData(sce)$ENSEMBL <- ensembl
sce
cell QC
該研究的最初作者已經在數據發表之前移除了低質量的細胞。盡管如此，我們使用scater (McCarthy et al. 2017)計算一些質量控制指標來檢查剩余的細胞是否令人滿意。
library(scater)
sce <- calculateQCMetrics(sce, feature_controls=list(Mt=is.mito))
我們檢查了QC指標在所有單元中的分布(圖1)。這里的庫大小至少比416B數據集中觀察到的要小一個數量級。這與使用UMI count而不是read count是一致的，因為每個轉錄分子只能產生一個UMI count，但在片段化后可以產生多個reads。此外，與416B數據集相比，spik - In比例變化更大。這可能反映了當存在多種細胞類型時，每個細胞內源性RNA總量的更大變異性。
par(mfrow=c(2,2), mar=c(5.1, 4.1, 0.1, 0.1))
hist(sce$total_counts/1e3, xlab="Library sizes (thousands)", main="",
breaks=20, col="grey80", ylab="Number of cells")
hist(sce$total_features_by_counts, xlab="Number of expressed genes", main="",
breaks=20, col="grey80", ylab="Number of cells")
hist(sce$pct_counts_Spike, xlab="ERCC proportion (%)",
ylab="Number of cells", breaks=20, main="", col="grey80")
hist(sce$pct_counts_Mt, xlab="Mitochondrial proportion (%)",
ylab="Number of cells", breaks=20, main="", col="grey80")
圖1:質控指標的直方圖，包括文庫的大小、表達基因的數量和UMIs在大腦數據集中所有細胞的spike-in 轉錄或線粒體基因中的比例。
我們刪除了庫大小和表示的特性數量的小異常值，并刪除了大異常值。再一次，有了線粒體轉錄的存在，就意味著我們不必使用線粒體的比例。
libsize.drop <- isOutlier(sce$total_counts, nmads=3, type="lower", log=TRUE)
feature.drop <- isOutlier(sce$total_features_by_counts, nmads=3, type="lower", log=TRUE)
spike.drop <- isOutlier(sce$pct_counts_Spike, nmads=3, type="higher")
然后通過組合所有指標的過濾器來移除低質量的細胞。大部分細胞被保留，這表明原來的質量控制程序一般是適當的。
sce <- sce[,!(libsize.drop | feature.drop | spike.drop)]
data.frame(ByLibSize=sum(libsize.drop), ByFeature=sum(feature.drop),
BySpike=sum(spike.drop), Remaining=ncol(sce))
我們可以進一步改進我們的細胞過濾程序，在離群點設置一個或多個已知因素的批次，例如，mouse/plate。如前所述，這將避免MAD的膨脹，提高功率來移除低質量的電池。但是，為了簡單起見，我們不會這樣做，因為已經執行了足夠的質量控制。
細胞周期分類
cyclone(Scialdone et al. 2015)對大腦數據集的應用表明，大多數細胞處于G1期(圖2)。這需要使用Ensembl標識符來匹配預定義的分類器。
library(scran)
mm.pairs <- readRDS(system.file("exdata", "mouse_cycle_markers.rds", package="scran"))
assignments <- cyclone(sce, mm.pairs, gene.names=rowData(sce)$ENSEMBL)
table(assignments$phase)
plot(assignments$score$G1, assignments$score$G2M, xlab="G1 score", ylab="G2/M score", pch=16)
圖2:在大腦數據集上應用基于成對分類器的細胞周期階段得分，其中每個點代表一個細胞。
然而，由于訓練數據集和測試數據集之間的差異，這個結果的完整性需要謹慎。該分類器在C1數據上進行訓練，并考慮到協議中的偏差。大腦數據集使用UMI計數，它有一組不同的偏差，例如，只有3 '端覆蓋，沒有長度偏差，沒有放大噪聲。此外，許多神經元細胞類型預計位于G0靜止期，這與細胞周期的其他階段不同(Coller, Sang, and Roberts 2006)。cyclone一般會將這些細胞分配到訓練集中已知的最近的階段，即G1。
基因水平的度量
圖3顯示了大腦數據集中細胞群中表達最高的基因。這主要是由spik -in轉錄本占據，反映了使用的spik -in濃度跨越整個表達范圍。與預期的一樣，也有一些組成性表達基因。
fontsize <- theme(axis.text=element_text(size=12), axis.title=element_text(size=16))
plotHighestExprs(sce, n=50) + fontsize
圖3:分配給大腦數據集中最豐富的50個特征的總計數的百分比。對于每個特性，每個條表示分配給單個cell的特性的百分比，而圓圈表示所有單元格的平均值。條形圖由每個cell中表示的特征的總數來著色，而圓形圖則根據該特征是否被標記為控制特征來著色。
通過計算所有細胞的平均計數來量化基因豐度(圖4)。如前所述，UMI計數通常低于read計數。
ave.counts <- calcAverage(sce, use_size_factors=FALSE)
hist(log10(ave.counts), breaks=100, main="", col="grey",
xlab=expression(Log[10]~"average count"))
我們將平均計數保存到singlecellexper對象中供以后使用。我們還刪除了平均計數為零的基因，因為這意味著它們在任何細胞中都不表達。
rowData(sce)$ave.count <- ave.counts
to.keep <- ave.counts > 0
sce <- sce[to.keep,]
summary(to.keep)
## Mode FALSE TRUE
## logical 2 19894
Normalization of cell-specific biases
我們使用computeSumFactors()函數和額外的預聚類步驟(Lun、Bach和Marioni 2016)對內源性基因進行標準化。每個集群中的單元單獨歸一化，并重新調整大小因子以使其在集群之間具有可比性。這就避免了假定大多數基因在整個種群中都是non-DE——在成對的簇之間只需要non-DE的多數。然后進行標準化，以確保不同集群中的細胞大小因子具有可比性。
- 我們使用平均計數閾值0.1來定義在標準化期間使用的高豐度基因。這低于min.mean=1的默認閾值，反映了UMI計數通常小于讀計數的事實。
- 我們通過快速降維來加速聚類，然后在pc上對單元進行聚類。這就是BSPARAM=參數的目的，它指示quickCluster()使用PCA的近似算法。這個近似依賴于隨機初始化，所以我們需要設置隨機種子的可重復性。
library(BiocSingular)
set.seed(1000)
clusters <- quickCluster(sce, use.ranks=FALSE, BSPARAM=IrlbaParam())
sce <- computeSumFactors(sce, cluster=clusters, min.mean=0.1)
summary(sizeFactors(sce))
與416B分析相比，每個細胞的總計數和大小因子之間的趨勢出現了更多的散點(圖5)。這與不同類型細胞之間DE的增加相一致，這影響了庫大小標準化的準確性(Robinson和Oshlack 2010)。相比之下，大小因子是根據中位數比值來估計的，并且對細胞間DE的存在更可靠。
plot(sizeFactors(sce), sce$total_counts/1e3, log="xy",
ylab="Library size (thousands)", xlab="Size factor")
圖5:來自池的大小因子，與大腦數據集中所有細胞的庫大小作圖。坐標軸以對數刻度表示。
還計算特定于spik -in集的大小因子，如前所述。
sce <- computeSpikeFactors(sce, type="Spike", general.use=FALSE)
最后，使用適當的大小因子計算每個內源性基因或spik -in轉錄本的歸一化對數表達值。
sce <- normalize(sce)
建模和消除技術噪音
我們通過使用trendVar()函數擬合spik -in轉錄本的均值-方差趨勢，對技術噪聲進行建模。
var.fit <- trendVar(sce, parametric=TRUE, loess.args=list(span=0.4))
var.out <- decomposeVar(sce, var.fit)
圖6顯示了趨勢與技術方差的精確擬合。技術和總方差也比416B數據集中的小得多。這是由于UMIs的使用，減少了可變PCR擴增引起的噪聲(Islam et al. 2014)。此外，內源基因的變異量始終低于內源基因的變異量。這反映了不同類型細胞間基因表達的異質性。
plot(var.out$mean, var.out$total, pch=16, cex=0.6, xlab="Mean log-expression",
ylab="Variance of log-expression")
points(var.out$mean[isSpike(sce)], var.out$total[isSpike(sce)], col="red", pch=16)
curve(var.fit$trend(x), col="dodgerblue", add=TRUE, lwd=2)
圖6:大腦數據集中所有細胞的歸一化對數表達值相對于每個基因平均值的方差。藍線代表的是在技術差異中，spik -in轉錄本的平均值相關趨勢(也用紅點表示)。
我們檢查具有最大生物成分的基因的表達值分布，以確保它們不會受到離群值的驅動(圖7)。
chosen.genes <- order(var.out$bio, decreasing=TRUE)[1:10]
plotExpression(sce, rownames(var.out)[chosen.genes],
point_alpha=0.05, jitter_type="jitter") + fontsize
圖7:大腦數據集中前10位HVGs的標準化日志表達式值的小提琴圖。對于每個基因，每個點表示單個細胞的對數表達值。
最后，我們使用PCA對表達式值進行降噪處理，為每個去除技術噪聲的單元格生成一組坐標。在()中設置BSPARAM=IrlbaParam()將使用來自irlba包的方法執行一個近似奇異值分解(SVD)。這比在大型數據集上的精確算法要快得多，而且不會損失很多精度。近似算法包含隨機初始化，因此我們設置種子以保證可重復性。
set.seed(1000)
sce <- denoisePCA(sce, technical=var.fit$trend, BSPARAM=IrlbaParam())
ncol(reducedDim(sce, "PCA"))
理論上，我們應該在每個細胞的原板上進行阻擋。然而，每個培養皿中只有20-40個細胞，而且種群的異質性也很強。這意味著我們不能假設每個平板上采樣的細胞類型的分布是相同的。因此，為了避免倒退出潛在的生物學，我們不會在這個分析中阻止任何因素。
denoisePCA()中PCs保留的上限由max指定。max.rank=參數,這是默認設置為100，以確保近似的SVD快速運行。雖然默認設置對于降維通常是令人滿意的，但rank可能更適合于極端異質的人群。
降維數據挖掘
我們在去噪后的PCs上進行降維，檢查是否有子結構。在圖8的t-SNE圖(Van der Maaten和Hinton 2008)中，細胞分裂成清晰的集群，對應不同的亞群。這與大腦中多種細胞類型的存在是一致的。我們增加了復雜性，以犧牲局部規模來支持整體結構的可視化。
set.seed(1000)
sce <- runTSNE(sce, use_dimred="PCA", perplexity=50)
tsne1 <- plotTSNE(sce, colour_by="Neurod6") + fontsize
tsne2 <- plotTSNE(sce, colour_by="Mog") + fontsize
multiplot(tsne1, tsne2, cols=2)
圖8:由去噪的腦數據集PCs構建的t-SNE圖。每個點代表一個細胞，并根據其Neurod6(左)或Mog(右)的表達進行著色。
PCA圖在將細胞分成許多不同的簇方面效果較差(圖9)，這是因為前兩個PCs是由特定亞群之間的強烈差異驅動的，這降低了其他一些亞群之間更細微差異的分辨率。盡管如此，仍然可以看到一些子結構。
pca1 <- plotReducedDim(sce, use_dimred="PCA", colour_by="Neurod6") + fontsize
pca2 <- plotReducedDim(sce, use_dimred="PCA", colour_by="Mog") + fontsize
multiplot(pca1, pca2, cols=2)
圖9:用去噪的大腦數據集PCs構建的PCA圖。每個點代表一個細胞，并根據其神經d6(左)或Mog(右)的表達進行著色。
對于這兩種方法，我們根據特定基因的表達為每個細胞上色。這是在低維空間中可視化表達式變化的有用策略。如果選擇的基因是特定細胞類型的已知標記，它也可以用來描述每個簇。例如，Mog可用于識別與少突膠質細胞相對應的簇。
聚類
降維坐標用于將細胞聚集成假定的亞群體。我們通過構建共享最近鄰圖(shared-nearest-neighbour，Xu和Su 2015)來做到這一點，其中單元是共享最近鄰的單元之間形成的節點和邊。然后使用igraph包中的方法將集群定義為圖中高度連接的細胞群落。這比形成成對距離矩陣對大量細胞的層次聚類更有效。
snn.gr <- buildSNNGraph(sce, use.dimred="PCA")
cluster.out <- igraph::cluster_walktrap(snn.gr)
my.clusters <- cluster.out$membership
table(my.clusters)
## my.clusters
## 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
## 103 200 234 191 194 355 161 658 384 85 90 16 209 38 45 26
我們在圖10中可視化了t-SNE圖中所有cell的集群分配。相鄰的cell通常被分配到相同的集群中，這表明該集群過程得到了正確的應用。
sce$cluster <- factor(my.clusters)
plotTSNE(sce, colour_by="cluster") + fontsize
圖10:腦數據集去噪PCs的t-SNE圖。每個點表示一個cell，并根據其指定的集群標識進行著色。
另一種方法是使用基于圖形(graph-based)的可視化，如強制導向的布局(force-directed layouts,圖11)。它們很有吸引力，因為它們直接表示集群期間使用的關系。然而，對于大型圖，收斂速度往往較慢，因此可能需要對niter=進行一些修改，以確保結果是穩定的。
set.seed(2000)
reducedDim(sce, "force") <- igraph::layout_with_fr(snn.gr, niter=5000)
plotReducedDim(sce, colour_by="cluster", use_dimred="force")
非常異構的數據集可能會在第一輪集群中產生一些大型集群。它可以是有用的重復方差建模，去噪和聚類只使用每個初始集群中的細胞。這可以通過根據my.clusters的特定級別設置sce來實現, 并在子集上重新應用相關函數。這樣做可能集中在一組不同的基因上，這些基因定義了一個初始簇內的異質性，而不是那些定義初始簇之間差異的基因。這將允許以更高的分辨率探索每個集群中的精細結構。不過，為了簡單起見，我們將只使用與此工作流中清除子種群相對應的廣泛集群。
igraph包中提供了許多不同的聚類方法。我們發現Walktrap算法通常是一個不錯的默認選擇(Yang, heimer, Tessone 2016)，盡管我們鼓勵用戶嘗試不同的算法。
在buildSNNGraph中減少鄰居k的數量會降低圖的連接性。這通常會導致形成更小的集群(Xu和Su 2015)，如果需要更大的分辨率，這可能是可取的。
注意，我們不運行library(igraph)，而是使用igraph::從包中提取方法。這是因為igraph包含一個規范化方法，它將覆蓋來自scater的對應方法，從而導致一些不尋常的bug。
模塊化評分為社區檢測方法提供了一個全局的集群性能度量。簡單地說，它將簇內邊緣的數量與隨機邊緣的空模型下的期望數量進行了比較。較高的模塊性分數(接近最大值1)表明被檢測到的簇的內部邊緣比較豐富，簇之間的邊緣相對較少。
igraph::modularity(cluster.out)
我們通過檢驗每對簇的邊的總權值來進一步研究簇。對于每一對，觀察到的總權重將與空模型下的預期值進行比較，類似于模塊化計算。大多數集群包含的內部鏈接比預期的多(圖12)，而集群之間的鏈接比預期的少。這表明我們成功地將細胞聚集成高度連接的社區。
mod.out <- clusterModularity(snn.gr, my.clusters, get.values=TRUE)
ratio <- mod.out$observed/mod.out$expected
lratio <- log10(ratio + 1)
library(pheatmap)
pheatmap(lratio, cluster_rows=FALSE, cluster_cols=FALSE,
color=colorRampPalette(c("white", "blue"))(100))
圖12:同一集群或不同集群中節點之間的總重量與隨機鏈接的空模型下的總重量之比log10的熱圖。
為了總結集群之間的關系，我們使用觀察到的總權重與期望總權重的比值來構建跨集群的圖。基于集群的圖可以使用力指向的布局來可視化，以識別高度互連的“集群的集群”。這類似于Wolf等人(2017)提出的“圖的抽象”策略。
cluster.gr <- igraph::graph_from_adjacency_matrix(ratio,
mode="undirected", weighted=TRUE, diag=FALSE)
plot(cluster.gr, edge.width=igraph::E(cluster.gr)$weight*10)
圖13:基于不同集群中節點間觀察到的總權值與期望總權值之比，力導向的布局顯示了集群之間的關系。一對簇之間的邊緣厚度與對應的比例成正比。
- 我們不使用剪影系數來評估聚類的大型數據集。這是因為cluster::silhouette需要構建一個距離矩陣，當涉及到許多細胞時，這可能是不可行的。
+從技術上講，模塊化分數是通過從期望總權重中減去觀測值得到的。我們使用這個比率，因為它保證是正的，并且不會因為每個簇中細胞數量的不同而出現大小上的差異。
marker genes
我們使用帶有direction="up"的findmarker函數來識別每個集群中上調的標記基因。如前所述，我們重點關注上調基因，因為這些基因可以快速在異質人群中提供細胞類型的陽性識別。我們研究了集群4的表，其中報告了集群4和其他每個集群之間的日志倍變化。為每個集群提供相同的輸出，以便識別區分集群的基因。
markers <- findMarkers(sce, my.clusters, direction="up")
marker.set <- markers[["4"]]
head(marker.set[,1:8], 10) # only first 8 columns, for brevity
## DataFrame with 10 rows and 8 columns
## Top p.value FDR
## <integer> <numeric> <numeric>
## Snap25 1 2.6436828195046e-260 5.24427360905115e-256
## Mllt11 1 2.64835618578792e-189 1.05070883314949e-185
## Gad1 1 6.21481316278381e-174 1.54104060887682e-170
## Atp1a3 1 2.42819725183299e-171 5.35201654273444e-168
## Celf4 1 2.1901645927764e-161 2.89641966846033e-158
## Rcan2 1 4.64612038923461e-99 1.35536897295951e-96
## Synpr 1 4.34116077754636e-75 5.66550041738068e-73
## Slc32a1 1 1.84158661555892e-65 1.63818626425301e-63
## Ndrg4 2 2.35144138055514e-242 2.33227713330369e-238
## Stmn3 2 6.36954591686139e-195 3.1588170588194e-191
## logFC.1 logFC.2 logFC.3
## <numeric> <numeric> <numeric>
## Snap25 1.2501919230692 0.67652736125569 3.68263627661648
## Mllt11 1.54667484840171 1.09590198758324 2.99539448469482
## Gad1 3.91523916973606 3.65238977769234 3.98295747045627
## Atp1a3 0.00896823664721724 0.962530545122529 3.26123555545746
## Celf4 0.44643142748766 0.740188939705178 2.71368354840561
## Rcan2 2.20233550942963 1.69523449324012 1.85629710950148
## Synpr 3.14964318830122 2.80066779182528 3.23587929298924
## Slc32a1 1.64312498454162 1.64133992421794 1.74089829213631
## Ndrg4 1.00144003064511 1.20871495924897 3.67086401750027
## Stmn3 1.77997011413237 1.01476517703874 4.20227407178467
## logFC.5 logFC.6
## <numeric> <numeric>
## Snap25 -0.298729905898302 0.717172380132666
## Mllt11 0.446025722578893 0.495996491073405
## Gad1 4.1518488345932 4.13283704263783
## Atp1a3 0.549478199572573 -0.211309991972772
## Celf4 -0.100730536941031 0.120453982728159
## Rcan2 1.15269900728503 2.30454808040103
## Synpr 3.04938017855904 3.25850885734223
## Slc32a1 1.74737321385146 1.7380206484717
## Ndrg4 0.3445857243819 0.754609477952267
## Stmn3 0.546398537343761 0.524932745209836
圖14顯示，與部分或全部其他簇相比，簇4細胞中的大多數頂標記都具有很強的DE。我們可以使用這些標記在獨立細胞群的驗證研究中識別來自cluster 4的細胞。快速查看標記表明，cluster 4代表基于Gad1和Slc6a1表達的間神經元(Zeng et al. 2012)，與cluster 11中緊密相關的細胞不同，后者具有較高的Synpr表達。
top.markers <- rownames(marker.set)[marker.set$Top <= 10]
plotHeatmap(sce, features=top.markers, columns=order(my.clusters),
colour_columns_by="cluster", cluster_cols=FALSE,
center=TRUE, symmetric=TRUE, zlim=c(-5, 5))
圖14:以平均值為中心的熱圖，以及大腦數據集中cluster 4頂部標記集的規范化日志表達式值。列顏色表示每個cell格被分配到的集群，如圖例所示。
另一種可視化方法是直接繪制所有其他集群的log變化(圖15)。這種方法更簡潔，在涉及許多包含不同數量cell的集群的情況下非常有用。
logFCs <- as.matrix(marker.set[1:50,-(1:3)])
colnames(logFCs) <- sub("logFC.", "", colnames(logFCs))
library(pheatmap)
max.lfc <- max(abs(range(logFCs)))
pheatmap(logFCs, breaks=seq(-5, 5, length.out=101))
圖15:與大腦數據集中的其他集群相比，第4集群頂部標記集的表達變化的熱度圖。
我們保存候選標記基因的列表以供進一步檢查，使用壓縮來減少文件大小。
gzout <- gzfile("brain_marker_1.tsv.gz", open="wb")
write.table(marker.set, file=gzout, sep="\t", quote=FALSE, col.names=NA)
close(gzout)
結論
完成基本分析后，我們將帶有相關數據的singlecellexper搽對象保存到文件中。這一點在這里尤其重要，因為大腦數據集非常大。如果要執行進一步的分析，就不方便重復上面描述的所有預處理步驟。
saveRDS(file="brain_data.rds", sce)
在這個工作流程中使用的所有軟件包都可以從綜合的R檔案網絡(https://cran.r-project.org)或Bioconductor項目(http://bioconductor.org)獲得。下面顯示了使用的包的具體版本號，以及R安裝的版本。
sessionInfo()
## R version 3.6.0 (2019-04-26)
## Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)
## Running under: Ubuntu 18.04.2 LTS
##
## Matrix products: default
## BLAS: /home/biocbuild/bbs-3.9-bioc/R/lib/libRblas.so
## LAPACK: /home/biocbuild/bbs-3.9-bioc/R/lib/libRlapack.so
##
## locale:
## [1] LC_CTYPE=en_US.UTF-8 LC_NUMERIC=C
## [3] LC_TIME=en_US.UTF-8 LC_COLLATE=C
## [5] LC_MONETARY=en_US.UTF-8 LC_MESSAGES=en_US.UTF-8
## [7] LC_PAPER=en_US.UTF-8 LC_NAME=C
## [9] LC_ADDRESS=C LC_TELEPHONE=C
## [11] LC_MEASUREMENT=en_US.UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C
##
## attached base packages:
## [1] parallel stats4 stats graphics grDevices utils datasets
## [8] methods base
##
## other attached packages:
## [1] pheatmap_1.0.12
## [2] scRNAseq_1.9.0
## [3] org.Mm.eg.db_3.8.2
## [4] readxl_1.3.1
## [5] TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.ensGene_3.4.0
## [6] GenomicFeatures_1.36.0
## [7] Matrix_1.2-17
## [8] edgeR_3.26.0
## [9] limma_3.40.0
## [10] BiocNeighbors_1.2.0
## [11] TENxBrainData_1.3.0
## [12] HDF5Array_1.12.0
## [13] rhdf5_2.28.0
## [14] Rtsne_0.15
## [15] BiocSingular_1.0.0
## [16] scran_1.12.0
## [17] scater_1.12.0
## [18] ggplot2_3.1.1
## [19] SingleCellExperiment_1.6.0
## [20] SummarizedExperiment_1.14.0
## [21] DelayedArray_0.10.0
## [22] BiocParallel_1.18.0
## [23] matrixStats_0.54.0
## [24] GenomicRanges_1.36.0
## [25] GenomeInfoDb_1.20.0
## [26] org.Hs.eg.db_3.8.2
## [27] AnnotationDbi_1.46.0
## [28] IRanges_2.18.0
## [29] S4Vectors_0.22.0
## [30] Biobase_2.44.0
## [31] BiocGenerics_0.30.0
## [32] BiocFileCache_1.8.0
## [33] dbplyr_1.4.0
## [34] knitr_1.22
## [35] BiocStyle_2.12.0
##
## loaded via a namespace (and not attached):
## [1] tidyselect_0.2.5 RSQLite_2.1.1
## [3] trimcluster_0.1-2.1 grid_3.6.0
## [5] ranger_0.11.2 munsell_0.5.0
## [7] destiny_2.14.0 codetools_0.2-16
## [9] statmod_1.4.30 sROC_0.1-2
## [11] withr_2.1.2 batchelor_1.0.0
## [13] colorspace_1.4-1 highr_0.8
## [15] robustbase_0.93-4 vcd_1.4-4
## [17] VIM_4.8.0 TTR_0.23-4
## [19] labeling_0.3 cvTools_0.3.2
## [21] GenomeInfoDbData_1.2.1 bit64_0.9-7
## [23] xfun_0.6 ggthemes_4.1.1
## [25] diptest_0.75-7 R6_2.4.0
## [27] ggbeeswarm_0.6.0 robCompositions_2.1.0
## [29] rsvd_1.0.0 RcppEigen_0.3.3.5.0
## [31] locfit_1.5-9.1 flexmix_2.3-15
## [33] mvoutlier_2.0.9 reshape_0.8.8
## [35] bitops_1.0-6 assertthat_0.2.1
## [37] promises_1.0.1 scales_1.0.0
## [39] nnet_7.3-12 beeswarm_0.2.3
## [41] gtable_0.3.0 beachmat_2.0.0
## [43] processx_3.3.0 rlang_0.3.4
## [45] scatterplot3d_0.3-41 splines_3.6.0
## [47] rtracklayer_1.44.0 lazyeval_0.2.2
## [49] BiocManager_1.30.4 yaml_2.2.0
## [51] abind_1.4-5 httpuv_1.5.1
## [53] tools_3.6.0 bookdown_0.9
## [55] zCompositions_1.2.0 RColorBrewer_1.1-2
## [57] proxy_0.4-23 dynamicTreeCut_1.63-1
## [59] Rcpp_1.0.1 plyr_1.8.4
## [61] progress_1.2.0 zlibbioc_1.30.0
## [63] purrr_0.3.2 RCurl_1.95-4.12
## [65] ps_1.3.0 prettyunits_1.0.2
## [67] viridis_0.5.1 cowplot_0.9.4
## [69] zoo_1.8-5 haven_2.1.0
## [71] cluster_2.0.9 magrittr_1.5
## [73] data.table_1.12.2 openxlsx_4.1.0
## [75] lmtest_0.9-37 truncnorm_1.0-8
## [77] mvtnorm_1.0-10 hms_0.4.2
## [79] mime_0.6 evaluate_0.13
## [81] xtable_1.8-4 smoother_1.1
## [83] XML_3.98-1.19 rio_0.5.16
## [85] mclust_5.4.3 gridExtra_2.3
## [87] compiler_3.6.0 biomaRt_2.40.0
## [89] tibble_2.1.1 crayon_1.3.4
## [91] htmltools_0.3.6 pcaPP_1.9-73
## [93] later_0.8.0 tidyr_0.8.3
## [95] rrcov_1.4-7 DBI_1.0.0
## [97] ExperimentHub_1.10.0 fpc_2.1-11.2
## [99] MASS_7.3-51.4 rappdirs_0.3.1
## [101] boot_1.3-22 car_3.0-2
## [103] sgeostat_1.0-27 igraph_1.2.4.1
## [105] forcats_0.4.0 pkgconfig_2.0.2
## [107] GenomicAlignments_1.20.0 foreign_0.8-71
## [109] laeken_0.5.0 sp_1.3-1
## [111] vipor_0.4.5 dqrng_0.2.0
## [113] XVector_0.24.0 NADA_1.6-1
## [115] stringr_1.4.0 callr_3.2.0
## [117] digest_0.6.18 pls_2.7-1
## [119] Biostrings_2.52.0 rmarkdown_1.12
## [121] cellranger_1.1.0 DelayedMatrixStats_1.6.0
## [123] kernlab_0.9-27 curl_3.3
## [125] modeltools_0.2-22 shiny_1.3.2
## [127] Rsamtools_2.0.0 Rhdf5lib_1.6.0
## [129] carData_3.0-2 viridisLite_0.3.0
## [131] pillar_1.3.1 GGally_1.4.0
## [133] lattice_0.20-38 survival_2.44-1.1
## [135] httr_1.4.0 DEoptimR_1.0-8
## [137] interactiveDisplayBase_1.22.0 glue_1.3.1
## [139] xts_0.11-2 zip_2.0.1
## [141] prabclus_2.2-7 simpleSingleCell_1.8.0
## [143] bit_1.1-14 class_7.3-15
## [145] stringi_1.4.3 blob_1.1.1
## [147] AnnotationHub_2.16.0 memoise_1.1.0
## [149] dplyr_0.8.0.1 irlba_2.3.3
## [151] e1071_1.7-1
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