title：Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis

journal：cell stem cell

IF: 21.46

摘要：精子發(fā)生產(chǎn)生成熟的雄性配子，對(duì)遺傳信息的跨代的穩(wěn)定傳遞時(shí)至關(guān)重要的。然而，人類生精過(guò)程的發(fā)育上的宏觀特征目前還是未知的。我們使用了單細(xì)胞RNAseq的技術(shù)檢測(cè)了來(lái)自具有正常生精過(guò)程的成年男性的2854個(gè)睪丸細(xì)胞，以及來(lái)自非梗阻性無(wú)精癥患者的174個(gè)睪丸細(xì)胞。我們建立了一個(gè)分級(jí)的模型，在這個(gè)模型中我們可以研究三種精原細(xì)胞、七種精母細(xì)胞和四種精子細(xì)胞的漸進(jìn)式的發(fā)育過(guò)程。隨后的分析中也鑒定出了一些人類生殖細(xì)胞的階段特異性的marker，比如說(shuō)HMGA1 PIWIL4 TEX29 SCML1 CCDC112等。更重要的是我們也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)NOA病人中睪丸體細(xì)胞的改變的基因表達(dá)模式（與正常相比），這為雄性不育的診斷提供了依據(jù)。我們的工作有助于研究人類生精過(guò)程中漸進(jìn)的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄圖譜的建立，這可以應(yīng)用到處理雄性相關(guān)的不育性疾病的診斷中。

介紹：精子發(fā)生是一個(gè)高度有序的能夠連續(xù)供應(yīng)精子的過(guò)程，其中精原細(xì)胞的維持，準(zhǔn)備和分化過(guò)程，以及隨后的減數(shù)分裂能力的獲得及精子形成的過(guò)程是其中至關(guān)重要的事件。以前的研究揭示了人類生殖細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄水平上特征，然而青春期后的睪丸中雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育的宏觀特征目前仍然未知。

人類生殖細(xì)胞的發(fā)育路徑圖有別于小鼠，比如說(shuō)人類精原細(xì)胞的擴(kuò)增效率就明顯低于其他物種，盡管一些研究已經(jīng)揭示了人類生殖細(xì)胞的一些細(xì)胞層面的特征，但是其轉(zhuǎn)錄層面和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前仍然未知。新發(fā)展的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以幫我們研究這些細(xì)胞內(nèi)的相互作用及細(xì)胞之間的異質(zhì)性，從而解決上述問(wèn)題。

不孕不育目前發(fā)病率為10%-15%，其中男性的因素占50%，然而男性不育的診斷及其中的病因?qū)W原理目前仍然缺乏理解，這主要是我們?nèi)狈梢灾甘净疾顟B(tài)的marker。另外，目前男性精子的體外產(chǎn)生也是跟小鼠一樣非常有希望，但是目前穩(wěn)健的產(chǎn)生雄性配子的方法目前仍然未知。因此人類精子發(fā)生的路線圖可以提供睪丸生殖細(xì)胞的特異性marker，同時(shí)也可以提供一些用于診斷男性不育生的marker。

結(jié)果：

1、人類睪丸細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組模式和細(xì)胞身份的確定

雄性成年人的樣本來(lái)自于兩類，一類是正常個(gè)體,另一類是OA病人，這兩類的捐獻(xiàn)者都有正常的生精上皮和成熟的精子。為了捕獲成年人睪丸中所有類型的細(xì)胞，一般采用兩種方法，第一種是隨機(jī)的細(xì)胞挑選（不篩選），另一類是通過(guò)FACS進(jìn)行細(xì)胞篩選。總的來(lái)說(shuō)，我們獲得了3059個(gè)人類睪丸細(xì)胞，其中通過(guò)質(zhì)檢的有2854個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，我們?cè)诿總€(gè)細(xì)胞中平均可檢測(cè)到7378個(gè)基因和122443條mRNA分子。

所有通過(guò)質(zhì)檢的2854個(gè)細(xì)胞最終被聚類為14個(gè)連續(xù)的簇和3個(gè)分離的簇

其中的marker檢驗(yàn)如下

SSC：GFRA1 UTF

differentiating spg? KIT MKI67

differentiated spg? STRA8

leptotene SPO11（減數(shù)分裂特異的雙鏈斷裂) SYCP1（聯(lián)會(huì)）TEX19（細(xì)線期中SPO11以來(lái)的減數(shù)分裂重組調(diào)控子）

zygotene 同上

pachytene? OVOL1 OVOL2 （偶線期和粗線期中定位在XY body上的蛋白）

diplotene??NME8(從粗線期精母細(xì)胞表達(dá)直到精子細(xì)胞早期階段) 同上

spc7（diakinesis metaphase anaphase telophase）： 同上

round spermatid TXNDC2（圓形精子和長(zhǎng)型精子的marker）TNP1 PRM1（精細(xì)胞和精子的marker）

elongated spermatid 同上

sertoli cell AMH SOX9

myoid cell? MYH11

lydig cell? DLK1

macrophages CD68 CD163

2、精子發(fā)生的基因表達(dá)和細(xì)胞特異性分子的表達(dá)模式

使用monocle做了無(wú)監(jiān)督的擬時(shí)間分析，獲得了人類精子形成過(guò)程中從SSC到S4階段的轉(zhuǎn)錄圖譜，其中未篩選的結(jié)果與篩選后的細(xì)胞的擬時(shí)間分析圖相似。

細(xì)胞周期狀態(tài)的評(píng)價(jià)是通過(guò)分析G1/S和G2/M時(shí)期特異的基因來(lái)完成的。在SSC中，細(xì)胞增值狀態(tài)相對(duì)靜止，當(dāng)SSC進(jìn)入分化狀態(tài)后，上述基因被激活，從分化完成的spg到L2時(shí)期的細(xì)胞，這種基因的表達(dá)一直存在，隨后在L3時(shí)期G1/S階段特異的基因表達(dá)下調(diào)，從粗線期到雙線期，G2/M階段特異性的基因表達(dá)上升，并最終在SPC7階段下降。經(jīng)過(guò)第二次細(xì)胞分裂后，精子細(xì)胞退出細(xì)胞周期并進(jìn)入精子形成過(guò)程。與生殖細(xì)胞相比，睪丸體細(xì)胞具有微弱的增殖活性，基本處于靜息狀態(tài)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了分化中的精原細(xì)胞到偶線期細(xì)胞高表達(dá)CCND1 CCNE2 CDK4等基因，它們會(huì)參與G1/S時(shí)期的進(jìn)程。相反的是,在粗線期到SPC7階段會(huì)高表達(dá)G2/M階段特異的基因CDK1 CCNA1 CCNA2 CCNB1 CCNB2等。

我們發(fā)現(xiàn)每一個(gè)cluster中都存在很少的特異性表達(dá)基因，包括SSC中的HMGA1,分化精原細(xì)胞中的PRAME,L1中的SCML1，L2中的DPH7，L3中的DSG3,偶線期中的TDRG1,粗線期中的CCDC112，雙線期中的AURKA，SPC7中的C9ORF116,S1中的TEX29,S2中的NFKBIB,S3中的IQCF3,S4中的LELP1等，同時(shí)使用RNA原位雜交和免疫染色等方式證明了單細(xì)胞得到的結(jié)果。

3、人類精原細(xì)胞的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)模式

在結(jié)果中，三種精原細(xì)胞被確定。對(duì)三種細(xì)胞的差異基因進(jìn)行分析，并結(jié)合生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行了解釋（略）

一些典型的精原細(xì)胞的marker在該數(shù)據(jù)集中被檢查。GFRA1是與精原細(xì)胞自我更新相關(guān)的，其作用是通過(guò)RET通路，另外NANOS2 ZBTB16 SALL4 POU3F UTF1 NANOS3等基因也在SSC的簇中高表達(dá)。同時(shí)FGFR3 BMPR1B等基因也共表達(dá)于該時(shí)期。

KIT是一種分化中的A類細(xì)胞的marker，高表達(dá)于cluster2，同時(shí)MKI67也有類似的表達(dá)模式，因此該簇為分化中的精原細(xì)胞

STRA8開(kāi)始表達(dá)于cluster2，高表達(dá)于cluster3 ，因此認(rèn)為cluster3為分化后的細(xì)胞

擬時(shí)間分析發(fā)現(xiàn)在SSC和分化中的精原細(xì)胞或者分化中的精原細(xì)胞與分化完成的精原細(xì)胞之間沒(méi)有重疊的亞群，因此認(rèn)為這之間存在中間轉(zhuǎn)化的狀態(tài)（重點(diǎn)！！！即劃分過(guò)于粗獷，大群中有亞群）。經(jīng)過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)SSC簇中可以繼續(xù)劃分為GFRA高UTF1低亞群和GFRA低UTF1高亞群，其中發(fā)現(xiàn)DMRT1高表達(dá)于前者的細(xì)胞群中，另外在兩個(gè)亞群的差異基因的篩選中得到了PIWIL4 ASB9 L1TD1等基因

隨后使用了免疫染色觀察了得到的幾個(gè)基因在生精細(xì)胞中的表達(dá)位置，得到結(jié)論：FGFR3(high)KIT(low)STRA8（neg）和BMPR1B(pos)KIT(low)STRA8(neg)均屬于SSC,而FGFR3(low)KIT（high）和BMPR1B(neg)KIT(high)屬于分化中的精原細(xì)胞，而FGFR3(neg)STRA8(pos)和BMPR1B（neg）STRA8(pos)屬于分化結(jié)束的精原細(xì)胞

作為SSC與精原細(xì)胞之間可能存在獨(dú)特的細(xì)胞周期的證據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)在精原細(xì)胞中獨(dú)特地表達(dá)UTF1和MKI67，這說(shuō)明SSC是睪丸中生殖干細(xì)胞自我更新的儲(chǔ)池，相反的KIT和MKI67在分化中的精原細(xì)胞中存在共定位，說(shuō)明了分化中的精原細(xì)胞存在細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化這兩個(gè)過(guò)程

我們還發(fā)現(xiàn)了分化后的精原細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)進(jìn)入L1階段，開(kāi)始表達(dá)減數(shù)分裂相關(guān)的marker，證明了在分化后的精原細(xì)胞中存在有絲分裂向減數(shù)分裂的過(guò)度階段。因?yàn)檫@個(gè)過(guò)程需要RA，因此對(duì)RA相關(guān)的酶做了分析，發(fā)現(xiàn)ALDH1A1和CYP26B1高表達(dá)于支持細(xì)胞和MIX中，ALDH1A2高表達(dá)于粗線期雙線期和SPC7中，ALDH1A3高表達(dá)于粗線期中

隨后作者看了BMP信號(hào)通路的關(guān)鍵因子在精原細(xì)胞階段的表達(dá)。

4、人類精母細(xì)胞的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)模式

對(duì)精母細(xì)胞的每個(gè)階段做了差異分析和GO分析，針對(duì)分析結(jié)果做了解釋

其中，我們發(fā)現(xiàn)了一些減數(shù)分裂重組的基因SPO11，DMC1 RAD51AP2高表達(dá)于細(xì)線期和偶線期階段。另外，聯(lián)會(huì)復(fù)合體的基因如SYCP3 SYCP1 SYCP2 SYCE1 TEX12等在細(xì)線期和偶線期均表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明這個(gè)階段是為后來(lái)的雙鏈DNA斷裂，同源染色體配對(duì)和聯(lián)會(huì)做準(zhǔn)備，在完成了減數(shù)分裂的重組過(guò)程后，伽馬H2AX的積聚在XYbody上發(fā)生，與這個(gè)現(xiàn)象一致的是OVOL1和OVOL2高表達(dá)于粗線期和偶線期階段。另外CCNA1和CCNA2高表達(dá)于粗線期和SPC7階段

SPC7階段包含了diakinesis, metaphase, anaphase, telophase, 和 secondary spermatocytes，CCNA1 CCNA2 TJP3 SLC26A3 SIRPG等在該階段均表達(dá)上調(diào)。另外ACR（一種頂體蛋白的前體形式）高表達(dá)于粗線期到S4階段，這與之前的報(bào)道，頂體蛋白可以在晚細(xì)線期到次級(jí)卵母細(xì)胞中均被檢測(cè)到。PNA是一種精子頂體的特異性蛋白，起始表達(dá)于粗線期。TJP3是高表達(dá)于SPC7到S1階段

組蛋白變體在染色質(zhì)重組和基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，我們發(fā)現(xiàn)在減數(shù)分裂前期聚集了一系列的組蛋白變體（重要！！！），

減數(shù)分裂性染色體失活發(fā)生在減數(shù)分裂前期，伽馬H2AX在粗線期時(shí)被發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明這段時(shí)間正在進(jìn)行MSCI，同時(shí)ATR H2AFX BRCA1 MDC1等也是在這個(gè)時(shí)期表達(dá)，另外我們發(fā)信啊TOPBP1 REC114 FAAP24和RAD51等也是在粗線期精母細(xì)胞中特異性表達(dá)上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄抑制僅僅發(fā)生在性染色體上，在粗線期精母細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平降到最低，并逐步上調(diào)直到SPC7階段。隨后對(duì)X和Y染色體的基因根據(jù)表達(dá)模式分為五個(gè)時(shí)期，發(fā)現(xiàn)21%精原細(xì)胞表達(dá)的X染色體基因在MSCI結(jié)束后重新被激活，73%的基因在S期被抑制，相反的，33%的精原細(xì)胞的Y染色體上的基因在MSCI后重新被激活，84%的基因在精子階段被抑制（重點(diǎn)！！！）

5、人類精子細(xì)胞的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)模式

首先對(duì)四個(gè)階段做了差異分析和GO分析，并對(duì)注釋的結(jié)果做了解釋

其次是，計(jì)算了四個(gè)階段檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)一個(gè)遞減的趨勢(shì)，說(shuō)明在精子形成過(guò)程中轉(zhuǎn)錄活性在逐漸被抑制，因此對(duì)差異基因做了趨勢(shì)分析，找到了被抑制和被重新激活的基因，并通過(guò)GO分析加以解釋。第三種模式的基因中呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，GO的注釋與微管相關(guān)，這與該階段發(fā)生的細(xì)胞質(zhì)的減少有關(guān)，在第四種模式中的基因呈現(xiàn)逐漸回升的趨勢(shì)，GO的注釋顯示與己糖的生物合成和氯化物的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，被認(rèn)為是與精子頂體的形成有關(guān)。

然后介紹了幾個(gè)marker基因，其中DDX4在S2時(shí)期表達(dá)下降，在S3到S4時(shí)期消失，同時(shí)S1和S2高表達(dá)精子特異性的基因如SUN5，在S2到S4時(shí)期，也存在SPEM1的高表達(dá)。

使用DDX4 TNP1 PRM1 PNA四個(gè)基因可以對(duì)S1-S3通過(guò)免疫熒光進(jìn)行定位，其中DDX4(+)TNP1(-)PRM1(-)和頂體泡狀PNA表示S1階段，DDX4(+)TNP1(+)PRM1(+)和新月?tīng)頟NA表示S2階段，DDX4(-)TNP1(+)PRM1(+)和帽狀表示S3階段，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)S3細(xì)胞的直徑明顯小于S1和S2，DDX4(-)TNP1(-)PRM1(+)表示S4階段

6、成年人睪丸中的體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式

? ? 支持細(xì)胞主要表達(dá)與固醇生物合成過(guò)程和性別決定相關(guān)的基因，MIX主要表達(dá)細(xì)胞黏附和胞外基質(zhì)形成的基因，巨噬細(xì)胞主要表達(dá)免疫應(yīng)答等相關(guān)的基因。支持細(xì)胞高表達(dá)一些分析，比如SPY NA5A1 DMRT1等，另外雄激素受體（AR）高表達(dá)在支持細(xì)胞和MIX中，而巨噬細(xì)胞中表達(dá)CD68和CD163以及IL10和CX3CR1

值得注意的是，MIX中包含了PMC和間質(zhì)細(xì)胞這兩類細(xì)胞

通過(guò)免疫染色，我們發(fā)現(xiàn)了SOX9特異性表達(dá)在支持細(xì)胞中，而間質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)INSL3.

7、人類精子發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)

ARACN算法來(lái)分析已知的所有1568個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，以此來(lái)找到在每個(gè)階段差異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。考慮到發(fā)育的順序，人有絲分裂停滯時(shí)期的胎兒生殖細(xì)胞與成年人的精原細(xì)胞是最相似的。因此對(duì)該類細(xì)胞進(jìn)行了重新分析，發(fā)現(xiàn)富集到一些與氧化還原和凋亡調(diào)控相關(guān)的基因，而成年男性睪丸中的SSC則伏擊到一些有性生殖和受精相關(guān)的基因。因此 認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子在胎兒生殖細(xì)胞向成年精原細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中的激活過(guò)程具有中關(guān)鍵的作用。

8、人類精子發(fā)生的單細(xì)胞數(shù)據(jù)可以作為診斷雄性生殖相關(guān)的疾病的參考

9、人類精子發(fā)生的單細(xì)胞數(shù)據(jù)可以作為研究人和小鼠精子發(fā)生保守型的依據(jù)。