第八講：單細胞軌跡推斷分析
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軌跡推斷分析可以幫助我們理解細胞狀態的改變的過程，尤其是在細胞分化方面。
上圖眼熟吧？是單細胞分析的一個經典的流程。做完聚類后，如果需要你可以做軌跡分析，通過軌跡分析你可以做差異基因的分析，從而得到細胞在分化過程中不同狀態下的基因表達差異。當然中間的流程是經典流程，你也可以根據你的需要從不同的步驟跳到軌跡分析。
那么實驗時間點的這個"time"，和發育的“time”有什么不一樣。前者就是我們平時說的“時間”，而后者說的是一種“擬時間”（pseudotime）。細胞按照擬時間的順序來進行分化。上圖中的坐標舉的例子是，橫坐標你用一種外界刺激使得細胞進行分化，那么縱坐標就是細胞分化的進程。需要注意的是，即便你在每一步都是homogenous的細胞群，你的所有細胞的分化速度都是不一樣的。比如上圖的9h，盡管很多細胞已經完全的分化了，但是仍然有少數細胞處在中間態，和完全沒有分化的狀態。這也就是“非同步化”。所以，在任何一個節點，你的所有的細胞個體都代表“這個瞬間”的分化狀態。
那是每個人都需要進行軌跡推斷分析嗎？當然不是。你需要確認的是你的dataset里是否涉及分化過程，或者你的細胞是否有“中間態”。比如：骨髓里的細胞，里面有很多“progenitor cells”，你就需要進行軌跡分析。再比如說你的樣品來自血液，血液里都是已經分化成熟的細胞了，基本上不用進行軌跡分析了。需要注意的是：有時候軌跡分析的結果在生物學上并沒有意義！所以最好是你已知一部分的分化軌跡，或者知道細胞在某一狀態的時候會表達什么基因。
現在有很多種方法可以進行軌跡分析。請注意，不同的軌跡分析軟件所對應的降維方法是不一樣的。如上圖所示。上圖沒有列出所有的降維方法，只是舉一些例子。
在講解軌跡分析方法之前，主講人想先介紹兩個之前沒提到過的降維方法：第一種，ICA：
如果你用monocle v1的話，就是ICA的方法。這種方法與PCA非常相似。區別是：ICA是分解你的data，PCA則是把highest variation分配到highest component里。
現在來詳細的看一下ICA到底是干什么的。上圖所示，在你的樣品里，包含有很多種生物signal，可能有受體信號、可能有細胞活化和增殖的信號、可能有細胞發育期間的Marker。但是當你把這些信號都combine的時候，就像右圖。ICA做的事就是分解你的data，使得你可以看到原始的生物信號。
ICA是怎么工作的呢？上圖左邊是PCA的圖，PCA是把highest variation找出來。作為第一主成分。而ICA是從你的data里找出最獨立的成分。但是ICA也有缺點：ICA假設它所找出來的生物信號都是相互獨立的。另一個就是每個信號的來源都是非高斯分布。這里不好理解，舉個例子：在教室里放4個麥克風，然后所有人在說話的時候，我們需要區分出究竟誰在說話。ICA可以分解出每一個人的聲音。這些聲音就是非高斯分布的。而在生物信號里，大部分的情況下，信號來源都是高斯分布的。即便是對于單個細胞來說，你也很難說是高斯分布，還是非高斯分布。
ICA是一個線性降維方法。可以分解你data里的不同生物信號來源，這種降維方法對后面的軌跡分析比較有利，它可以分辨出哪個信號先出現，哪個信號后出現。但是這種方法有時候在分析單細胞數據的時候得到的結果并不真實。而且ICA默認的是所有的信號來源是同等重要的，但事實并不是。
下一個主講人想講的是另一種之前沒提到的降維方法，diffusion maps。
diffusion maps是一種非線性降維方法。它是基于計算“probability”進行工作的。舉個例子：從點1到點6，你可以選擇一條路徑1>2>6。這就是2步。你也可以選擇3步，比如1>4>5>6和1>4>7>6。它計算的是“可能性”。
簡單的來說：為了把可能性轉化成距離，DM計算B到C的可能性，再計算A到C的可能性，根據公式，如果兩種可能性差不多大，那么它們的差值就趨近于0。說明A到B的過程可以通過C來很好的連接起來。
在了解了兩種降維方式之后，我們可以來看如何建立細胞之間的關系。從而我們可以知道我們應該從哪里開始建立軌跡，又在哪里結束。一種方法叫做“MST”（翻譯過來叫：最小生成樹）。
先來舉個簡單的例子，上圖里有很多個點，每一個點之間的距離你都可以量的出來。或者你用上面提到的diffusion map可以計算出每個點之間的“可能性”。然后你可以把每一個點連線，黑色的粗線就是最小生成樹。怎么理解呢？為什么說是最小生成樹呢？這個“最小”怎么理解？我們要找到一個“把所有的點連在一起時，相加的數最小”的方式。（把這句加粗的句子多讀幾遍，就理解了）另外加一句，如果你分析前就知道你的發育起始點，或者例如干細胞，那就會相對容易很多。
需要注意的是：MST沒有循環！所以如果你研究的生物過程是細胞增殖（周期），那你就不能用這個方法。
第二個方法建立細胞軌跡，這個方法就是現在monocle 2使用的方法。叫做反向圖嵌入。
為什么使用這個方法呢？上圖，A比如說是一個最小生成樹得到的軌跡推斷。如果你把其中一個點的位置稍稍挪一下，像B圖那樣，你會發現細胞軌跡完全就改變了！因為最小生成圖非常依賴于每一個點。所以這個RGE的方法是像C圖一樣，先把你的細胞或者樣品做cluster，根據這些細胞的平均值來畫軌跡圖。
上圖顯示的是RGE的一個工作原理圖。從左上角的紅點那個圖看起，你有很多個點在多維的空間里。然后你用各種方法做了降維（第一行中間圖）。之后根據一些clustering來假設一個軌跡。接下來（第二行右圖）RGE所做的事就是：由于有些點離這個假設的軌跡比較遠，它就把每一個點分配到離點最近的軌跡的部分上。然后更新中心點，將二維的軌跡投影到多維空間里，比較是否和原始的數據相吻合，如果不是，它會再回到降維后的那一步，循環這個過程。這個過程實際上很像前面講降維里的tSNE和UMAP的循環。直到這個細胞軌跡與原始data非常符合。這時你可以選擇這個軌跡的root，這樣你就可以定義你的“擬時間”或者是“發育軌跡”了。另外根據你的軌跡圖里的“分叉”，你還可以定義你的cell fate。
根據RGE的idea，這兩年又發展不少新的方法。你不需要掌握這么多方法，會一個，會用就行了。
這是Monocle v3的一個工作流程。首先拿到你的dataset> 標準化你的data > 降維> 聚類 > 建立你的tree（擬時間）> 差異基因分析。
現在介紹一個新的模型：RNA velocity。有道翻譯：RNA速度。這個模型是基于生物學概念的一個模型。是一個基因表達的軌跡推斷模型。
學生物的都知道，mRNA剛轉錄出來的時候，是沒有經過剪切的。里面有內含子。剪切后，你會得到spliced mRNA。這是編碼蛋白的。你同時還會有一些mRNA降解。這個模型可以看什么？上圖右邊的6張圖，每一個點是一個細胞，你可以比較在擬時間線上的一個瞬時的點，“經過剪切的mRNA”和“未經剪切的mRNA”哪一個要更提前。
來看一個更為直接的例子：上圖紅色代表未剪切的mRNA，藍色代表剪切的mRNA，兩個群分別代表你所有的細胞的兩個基因的表達情況。根據生物學概念來推斷，你的這些細胞的狀態應該是從左往右的。所以這樣一來，你就知道你的軌跡應該是從哪里開始了。這個模型可以讓你定義你的軌跡的“起點”、“終點”和“分支”。
這個模型的好處還有一個：它可以建立一個循環的軌跡。
下面總結一下：
在實際的實驗中，多維空間里的距離常常反映了細胞群之間的基因表達差異，而不是真正意義上的“時間”。所以才把這一個概念稱為“擬時間”。你的樣品里需要包含一個連續的細胞狀態。如果你的細胞群是完全獨立的、完全不同的，有可能你會得到錯誤的結果，或者得到一個不太好的軌跡圖。第三，如果你是研究細胞分化過程，最好設計多個實驗取材的時間點。
