第四講：Removal of confounding factors
由于這一講并不是每個人都用的上（我就用不上。。。），是關于單細胞測序實驗設計中的混雜因素的去除。所以我就聽了聽，權當學習了。有需要的同學可以仔細聽一下。主講人舉了個例子，比如在oral cancer里，飲酒是oral cancer的主要因素，而smoking這一因素會對結果也產(chǎn)生影響，所以需要去除（看起來臨床的同學可能會用到）。
主講人介紹了幾種去除這種variable的方法。

視頻地址：https://www.youtube.com/watch?v=rhuYhD4GwKw&list=PLjiXAZO27elC_xnk7gVNM85I2IQl5BEJN&index=4

實戰(zhàn)練習地址：https://github.com/NBISweden/excelerate-scRNAseq/blob/master/session-normalization/confounding-factors.md

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第五講：單細胞測序的數(shù)據(jù)整合
視頻地址：https://www.youtube.com/watch?v=4KwW90RQz-8&list=PLjiXAZO27elC_xnk7gVNM85I2IQl5BEJN&index=5
實戰(zhàn)練習：代碼及數(shù)據(jù)下載：https://github.com/NBISweden/excelerate-scRNAseq/blob/master/session-integration/Data_Integration.md

為什么要數(shù)據(jù)整合呢？比如說你用的是不同病人的樣品，你要比較不同condition的樣品，比如sick 和healthy。或者你有好幾個單細胞測序的dataset想要放在一起分析，這時候你就需要用到數(shù)據(jù)整合了。

這里是一個例子，是人類的胰腺的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)是來自不同的實驗的。雖然都是人類組織，但是是來自8個不同的datasets。

如果你把它們放在一起的話，就像上圖左邊的那種效果，非常明顯的batch effects。這時候不同的顏色代表著不同的批次，而不是不同細胞群的cluster。而右邊的圖就是整合之后的數(shù)據(jù)，這時的不同的細胞群才代表著你數(shù)據(jù)里真實的細胞分群。

這些batch effects是怎么來的呢？主要有兩個來源：technical and biological. 技術方面的batch effect主要是你的樣品質量、操作過程，或者是你用了兩種不一樣的platform去做測序，也可能你在裂解細胞的時候不同批次下細胞的狀態(tài)不一樣。biological方面的variation，也就是nature variation，一般是指不同的病人樣品，不同的老鼠樣品。

所以你需要花些時間來設計你的實驗，而不是上來就kuang kuang kuang的開干。上圖左邊的那種實驗設計，把3種處理分別用了3批進行操作。這種操作四絕不可取的！你要做的是像右邊那樣的實驗設計，每一次處理都包括你的所有condition。

Bulk-RNA-seq 的批次效應的去除方法現(xiàn)在已經(jīng)很成熟了，有很多種方法可以用（上面這些）。但是這些是否適用于單細胞測序呢？很難說它們是否真正適用或者不適用。主講人介紹他將介紹如何去除單細胞測序中的批次效應。

這里已經(jīng)有一些方法可以去除單細胞測序中的批次效應，這些方法大致可以分成兩個類別：一個是依賴于降維的方法，另一類是依賴于graph-based joint clustering。主講人接下來只針對里面的個別方法進行講解。

上圖是舉個例子，來說明MNN方法。這里有兩個batch，在batch 1里有3個細胞群，在batch 2里有相對應的3個細胞群。MNN的方法是：a圖里batch 1的紅色細胞群尋找的是batch2里與之相似的細胞群，然后batch2里的紅色細胞群也在尋找batch1里和自己相似的群，然后找到之后，計算correction vectors，有了correction vectors，就可以去除兩個batch間的批次效應，從而將兩個batch整合在一起。但是有時也會存在無法整合的情況，比如上圖里batch2的黃色細胞群。（所以整合的效果很看重數(shù)據(jù)的順序）

這張就是MNN的原理了。（這部分實在是聽不懂，關于MNN原理可以自行搜索，我也不太關注原理，我的目的就是知道這方法是干什么的就行了。。。）簡單的就是：上圖里最下面的網(wǎng)格圖，藍色的batch B經(jīng)過correction vector的矯正后，就可以和batch A進行merge了。

上圖是兩個datasets,分別來自SMART-seq2和MARS-seq測序結果。f圖是沒有經(jīng)過批次效應處理的，可以看到明顯的有批次效應。然后分別用不同的方法進行批次效應處理（g,h,i），貌似看起來MNN的方法效果最好。

Seurat V3的方法實際上是相似的，首先還是要先找到datasets之間對應的細胞，計算對應的細胞之間的factor，然后再進行校正。

這里主講人的一張PPT非常形象的介紹了PCA。他用魚來舉例子，這里只有兩個特征變量：高，寬。如果把圖里所有的魚的高和寬用點來表示，應該是右圖里的紅點那樣，寬度是最主要的feature。所以你的data里用PCA畫出來的圖，是你的數(shù)據(jù)里最明顯的兩個特征。

上面講的是PCA，那么什么是CCA呢？CCA和PCA是非常類似的。現(xiàn)在你想要從2個甚至更多的datasets里找出主要的variation來源。如果你做PCA分析，你會得到上面作圖的那種結果。但如果你做CCA分析，你會發(fā)現(xiàn)兩個batch重疊在一起。因為你想得到的不是兩個datasets之間的區(qū)別，而是想得到dataset里主要的variation。

上面這張圖展示的是Seurat v3里FindIntegrationAnchors這個功能的原理圖，其中一個dataset作為參考（reference），另一個dataset作為Query(查詢)，也是尋找兩個dataset之間的mutual nearest neighbor（在這里被稱為anchor）。然后你會得到評分（score），從而得知這個anchor是否good。

這個方法很新，但是和CCA很像。是一種集成非負矩陣分解（iNMF）的方法，名為LIGER。這原理我也這種方法不得了，它可以將兩個不同模態(tài)的數(shù)據(jù)集整合在一起。什么意思呢？舉個例子：它可以整合RNA-seq和DNA甲基化的dataset。比如下面這個：

這有一種方法稱為KBET，它也是一種用于量化單細胞測序不同Dataset之間的批次效應。

上面講了很多的方法，但是無法證明哪一個方法更好、更適用于你的實驗。你只能通過不同的嘗試去看哪一種可以給你最好的結果。