全部流程來自：GEO數據庫挖掘—生信技能樹B站視頻，建議去看原文！

第一步：找到相關的GEO數據集（文獻/搜索），以胃癌gastric cancer為例

可去文獻中查找，用于練習

第二步：運行R包GEOquery獲取數據（非常看網速，盡量下載下一點的包）

library(GEOquery)

eSet <- getGEO("GSE118916",

? ? ? ? ? ? ? destdir = '.',? ?#下載在當前目錄

? ? ? ? ? ? ? getGPL = F)??#平臺信息不要

#查看下載得到的文件大小，與GEO網頁中標識的是否一致

第三步：得到表達矩陣

#使用列表取子集的方法提取eSet列表里的第一個元素：eSet[[1]]；并使用exprs函數把它轉化成矩陣：exp <- exprs(eSet[[1]])

eSet[[1]]

exp <- exprs(eSet[[1]])

exp[1:4,1:4]#查看前四行

#代碼邏輯，把probe_id轉換為--->symbol ID/entrez ID

#分兩步走：過濾probe_id，得到每個基因所對應的唯一的probe_id

得到probe_id與symbol ID這件的轉換關系

ID轉換的第一步必須要加載特定的R包，下載哪個包，需要根據GPL來定

eSet[[1]]@annotation #查看GPL平臺信息，即芯片信息

#Google直接搜索相關R包，安裝并調用

#如果有對應的R包

library(R包)

#如果找不到R包

library(Biobase)

library(GEOquery)

gpl<-getGEO('GPL15297',destdir=".")

colnames(Table(gpl))

head(Table(gpl)[,c(1,15,19)])## you need to check this , which column do you need

probe2symbol=Table(gpl)[,c(1,15)]

write.csv(Table(gpl)[,c(1,15)],"GPL15207.csv")

tail(sort(table(ids$symbol)))#看高頻數的樣本

table(rownames(exp)%in%ids$probe_id)#查看exp與id是否一致

exp=exp[rownames(exp)%in%ids$probe_id,]#去除不一致的項

ids=ids[match(rownames(exp),ids$probe_id),]#使exp與id完全對應

tmp=by(exp,ids$symbol,function(x)rownames(x)[which.max(rowMeans(x))])

probes=as.character(tmp)

dim(exp)

exp=exp[rownames(exp)%in%probes,]# 過濾有多個探針的基因

dim(exp)

rownames(exp)=ids[match(rownames(exp),ids$probe_id),2]

head(exp)

第四步：獲取分組信息

pd <-pData(eSet[[1]])

library(stringr)

group_list=ifelse(str_detect(pd$title,"Control")==TRUE,"contorl","treat")group_list

str_detect(pd$title,"Control")

方法二：自己根據CSV里文件類型自己寫代碼

group_list=c(rep("control",times=3),rep("treat",times=3))

第五步：檢查表達矩陣

方法一：管家基因

exp['GAPDH',]#檢驗用的管家基因

exp['ACTB',]#同上

boxplot(exp)

#使用ggplot2畫各個樣本表達量的boxplot圖

# 準備畫圖所需數據exp_L

library(reshape2)

head(exp)

exp_L=melt(exp)

head(exp_L)

colnames(exp_L)=c('symbol','sample','value')

head(exp_L)

# 獲得分組信息

library(stringr)

group_list=ifelse(str_detect(pd$title,"Control")==TRUE,"contorl","treat")

group_list

exp_L$group=rep(group_list,each=nrow(exp))

head(exp_L)

# ggplot2畫圖 library(ggplot2)

p=ggplot(exp_L,aes(x=sample,y=value,fill=group))+geom_boxplot()

print(p)

##boxplot圖精修版p=ggplot(exp_L,aes(x=sample,y=value,fill=group))+geom_boxplot()

p=p+stat_summary(fun.y="mean",geom="point",shape=23,size=3,fill="red")

p=p+theme_set(theme_set(theme_bw(base_size=20)))

p=p+theme(text=element_text(face='bold'),axis.text.x=element_text(angle=30,hjust=1),axis.title=element_blank())

print(p)

#查案畫出的箱型圖，如果均值不在一條線上，說明樣本有批次效應，需要人工校正

library(limma)

exp=normalizeBetweenArrays(exp)

#除了箱型圖還可以畫其他的圖

p=ggplot(exp_L,aes(x=sample,y=value,fill=group))+geom_violin()

print(p)

p=ggplot(exp_L,aes(value,fill=group))+geom_histogram(bins=200)+facet_wrap(~sample,nrow=4)

print(p)

p=ggplot(exp_L,aes(value,col=group))+geom_density()+facet_wrap(~sample,nrow=4)

print(p)

p=ggplot(exp_L,aes(value,col=group))+geom_density()

print(p)

第四步：檢查樣本信息，檢查樣本分組信息，一般看PCA圖，hclust圖

# 更改表達矩陣列名

head(exp)

colnames(exp)=paste(group_list,1:6,sep='')

head(exp)

# 定義nodePar

nodePar<-list(lab.cex=0.6,pch=c(NA,19),cex=0.7,col="blue")

# 聚類

hc=hclust(dist(t(exp)))

par(mar=c(5,5,5,10))

# 繪圖

plot(as.dendrogram(hc),nodePar=nodePar,horiz=TRUE)

#繪PCA圖

library(ggfortify)

# 互換行和列，再dim一下df=as.data.frame(t(exp))

# 不要view df，列太多，軟件會卡住；

dim(df)

dim(exp)

exp[1:6,1:6]

df[1:6,1:6]

df$group=group_list

autoplot(prcomp(df[,1:ncol(df)-1)]),data=df,colour='group')

#保存數據

save(exp,group_list,file="step2output.Rdata")

第五步：差異分析

#limma包需要以下三個數據，表達矩陣(exp)；分組矩陣(design)；差異比較矩陣(contrast.matrix)

#表達矩陣(exp)我們早就得到了，不用再制作了；我們也得到了存放分組信息的向量group_list，用它來制作我們的分組矩陣

rm(list=ls())## 魔幻操作，一鍵清空

options(stringsAsFactors=F)

load(file="step2output.Rdata")#上步得到的EXP分組信息

dim(exp)

library(limma)# 做分組矩陣?

design<-model.matrix(~0+factor(group_list))

colnames(design)=levels(factor(group_list))

rownames(design)=colnames(exp)

design#查看得到的分組矩陣

#輸入數據—差異比較矩陣

contrast.matrix<-makeContrasts(paste0(c("treat","contorl"),collapse="-"),levels=design)

contrast.matrix

#limma包做差異分析，只有三個步驟：lmFit，eBayes，topTable

##step1

fit<-lmFit(exp,design)

##step2

fit2<-contrasts.fit(fit,contrast.matrix)##這一步很重要，大家可以自行看看效果fit2<-eBayes(fit2) ##default no trend!!!

##eBayes()withtrend=TRUE

##step3

tempOutput=topTable(fit2,coef=1,n=Inf)nrDEG=na.omit(tempOutput)

#可以保存數據 write.csv(nrDEG2,"limma_notrend.results.csv",quote = F)

head(nrDEG)

save(nrDEG,file="DEGoutput.Rdata") #保存差異數據nrDEG

#檢查差異數據的準確性，進行可視化

#熱圖

rm(list=ls())## 魔幻操作，一鍵清空

options(stringsAsFactors=F)

load(file="DEGoutput.Rdata")

load(file="DEGinput.Rdata")

library(pheatmap)

choose_gene=head(rownames(nrDEG),25)

choose_matrix=exp[choose_gene,]

choose_matrix=t(scale(t(choose_matrix)))

pheatmap(choose_matrix)

#火山圖

rm(list=ls()) ## 魔幻操作，一鍵清空

options(stringsAsFactors=F)

load(file="DEGoutput.Rdata")

colnames(nrDEG)

plot(nrDEG$logFC,-log10(nrDEG$P.Value))

DEG=nrDEG

logFC_cutoff<-with(DEG,mean(abs(logFC))+2*sd(abs(logFC)))DEG$change=as.factor(ifelse(DEG$P.Value<0.05&abs(DEG$logFC)>logFC_cutoff,ifelse(DEG$logFC>logFC_cutoff,'UP','DOWN'),'NOT'))

head(DEG)

g=ggplot(data=DEG,aes(x=logFC,y=-log10(P.Value),color=change))+geom_point(alpha=0.4,size=1.75)+theme_set(theme_set(theme_bw(base_size=20)))+xlab("log2 fold change")+ylab("-log10 p-value")+ggtitle(this_tile)+theme(plot.title=element_text(size=15,hjust=0.5))+scale_colour_manual(values=c('blue','black','red'))

print(g)

第六步：富集分析

#KEGG富集分析

library(clusterProfiler)

gene_up=deg[deg$change=='up','ENTREZID']

gene_down=deg[deg$change=='down','ENTREZID']

gene_diff=c(gene_up,gene_down)

gene_all=deg[,'ENTREZID']

kk.up<-enrichKEGG(gene=gene_up,organism='hsa',universe=gene_all,pvalueCutoff=0.9,qvalueCutoff=0.9)

head(kk.up)[,1:6]

dim(kk.up)

kk.down<-enrichKEGG(gene=gene_down,organism='hsa',universe=gene_all,pvalueCutoff=0.9,qvalueCutoff=0.9)

head(kk.down)[,1:6]

dim(kk.down)

kk.diff<-enrichKEGG(gene=gene_diff,organism='hsa',pvalueCutoff=0.05)

head(kk.diff)[,1:6]

kegg_diff_dt<-kk.diff@result

down_kegg<-kk.down@result%>%

? ? filter(pvalue<0.05) %>%mutate(group=-1)

up_kegg<-kk.up@result%>%

? ? filter(pvalue<0.05) %>%mutate(group=1)

kegg_plot<-function(up_kegg,down_kegg)

{

dat=rbind(up_kegg,down_kegg)colnames(dat)

dat$pvalue=-log10(dat$pvalue)

dat$pvalue=dat$pvalue*dat$group

dat=dat[order(dat$pvalue,decreasing=F),]

g_kegg<-ggplot(dat,aes(x=reorder(Description,order(pvalue,decreasing=F)),y=pvalue,fill=group))+geom_bar(stat="identity")+scale_fill_gradient(low="blue",high="red",guide=FALSE)+scale_x_discrete(name="Pathway names")+scale_y_continuous(name="log10P-value")+coord_flip()+theme_bw()+theme(plot.title=element_text(hjust=0.5))+ggtitle("Pathway Enrichment")

}

g_kegg<-kegg_plot(up_kegg,down_kegg)

g_kegg

ggsave(g_kegg,filename='kegg_up_down.png')#繪圖并保存

#GSEA是另一個常用的富集分析方法，目的是看看基因全局表達量的變化是否有某些特定的基因集合的傾向性。

data(geneList,package="DOSE")

head(geneList)

length(geneList)

names(geneList)

boxplot(geneList)

boxplot(deg$logFC)

geneList=deg$logFC

names(geneList)=deg$ENTREZID

geneList=sort(geneList,decreasing=T)

kk_gse<-gseKEGG(geneList=geneList,organism='hsa',nPerm=1000,minGSSize=120,pvalueCutoff=0.9,verbose=FALSE)

head(kk_gse)[,1:6]

gseaplot(kk_gse,geneSetID=rownames(kk_gse[1,]))

down_kegg<-kk_gse[kk_gse$pvalue<0.05&kk_gse$enrichmentScore<0,];down_kegg$group=-1

up_kegg<-kk_gse[kk_gse$pvalue<0.05&kk_gse$enrichmentScore>0,];up_kegg$group=1

gse_kegg=kegg_plot(up_kegg,down_kegg)

print(gse_kegg)

ggsave(gse_kegg,filename='kegg_up_down_gsea.png')

#GO富集分析

GO富集分析原理：有一個term注釋了100個差異表達基因參與了哪個過程，注釋完之后（模式生物都有現成的注釋包，不用我們自己注釋），計算相對于背景它是否顯著集中在某條通路、某一個細胞學定位、某一種生物學功能。

對GO database analysis一般從三個層面進行：

Cellular component，CC? 細胞成分

Biological process， BP? 生物學過程

Molecular function，MF? 分子功能

這三個層面具體是指：

Cellular component解釋的是基因存在在哪里，在細胞質還是在細胞核？如果存在細胞質那在哪個細胞器上？如果是在線粒體中那是存在線粒體膜上還是在線粒體的基質當中？這些信息都叫Cellular component。

Biological process是在說明該基因參與了哪些生物學過程，比如，它參與了rRNA的加工或參與了DNA的復制，這些信息都叫Biological process

Molecular function在講該基因在分子層面的功能是什么？它是催化什么反應的？

library(clusterProfiler)

gene_up=deg[deg$change=='up','ENTREZID']

gene_down=deg[deg$change=='down','ENTREZID']

gene_diff=c(gene_up,gene_down)

head(deg)

#細胞組分

ego_CC<-enrichGO(gene=gene_diff,OrgDb=org.Hs.eg.db,ont="CC",pAdjustMethod="BH",minGSSize=1,pvalueCutoff=0.01,qvalueCutoff=0.01,readable=TRUE)

#生物過程，重要

ego_BP<-enrichGO(gene=gene_diff,OrgDb=org.Hs.eg.db,ont="BP",pAdjustMethod="BH",minGSSize=1,pvalueCutoff=0.01,qvalueCutoff=0.01,readable=TRUE)

#分子功能，很重要

ego_MF<-enrichGO(gene=gene_diff,OrgDb=org.Hs.eg.db,ont="MF",pAdjustMethod="BH",minGSSize=1,pvalueCutoff=0.01,qvalueCutoff=0.01,readable=TRUE)

save(ego_CC,ego_BP,ego_MF,file="ego_GPL6244.Rdata")

rm(list=ls())

load(file="ego_GPL6244.Rdata")

#第一種，條帶圖，按p從小到大排的#如果運行了沒出圖，就dev.new()

barplot(ego_CC,showCategory=20,title="EnrichmentGO_CC")

barplot(ego_BP,showCategory=20,title="EnrichmentGO_CC")

#第二種，點圖，按富集數從大到小的dotplot(ego_CC,title="EnrichmentGO_BP_dot")

#保存

pdf(file="dotplot_GPL6244.pdf")

dotplot(ego_CC,title="EnrichmentGO_BP_dot")

dev.off()