Hifiasm 使用教程

介紹

Hifiasm 是一個快速的單倍型解析 de novo 組裝軟件，最初設計用于 PacBio HiFi 讀取。其最新版本可以通過利用超長的 Oxford Nanopore 讀取支持端粒到端粒的組裝。Hifiasm 可以生成單樣本端粒到端粒的組裝，結合了 HiFi、超長和 Hi-C 讀取，可以說是最好的組裝軟件之一。對于 trio-binning 組裝來說，它是最好的單倍型解析組裝軟件之一，適用于父本短讀取。對于人類基因組來說，hifiasm 可以在一天內完成端粒到端粒的組裝。

安裝

# 安裝 hifiasm (需要有g++和zlib)
git clone https://github.com/chhylp123/hifiasm
cd hifiasm && make

# 用conda安裝
conda install -c bioconda hifiasm

# 直接使用集群module
module load hifiasm/0.19.9

# 用測試數據運行 (用-f0來處理較小的數據集)
wget https://github.com/chhylp123/hifiasm/releases/download/v0.7/chr11-2M.fa.gz
./hifiasm -o test -t4 -f0 chr11-2M.fa.gz 2> test.log
awk '/^S/{print ">"$2;print $3}' test.bp.p_ctg.gfa > test.p_ctg.fa  # 在FASTA獲得主要的contigs

軟件參數

$ hifiasm
Usage: hifiasm [options] <in_1.fq> <in_2.fq> <...>
Options:
  Input/Output:
    -o STR       prefix of output files [hifiasm.asm]
    -i           ignore saved read correction and overlaps
    -t INT       number of threads [1]
    -z INT       length of adapters that should be removed [0]
    --version    show version number
  Overlap/Error correction:
    -k INT       k-mer length (must be <64) [51]
    -w INT       minimizer window size [51]
    -f INT       number of bits for bloom filter; 0 to disable [37]
    -D FLOAT     drop k-mers occurring >FLOAT*coverage times [5.0]
    -N INT       consider up to max(-D*coverage,-N) overlaps for each oriented read [100]
    -r INT       round of correction [3]
  Assembly:
    -a INT       round of assembly cleaning [4]
    -m INT       pop bubbles of <INT in size in contig graphs [10000000]
    -p INT       pop bubbles of <INT in size in unitig graphs [0]
    -n INT       remove tip unitigs composed of <=INT reads [3]
    -x FLOAT     max overlap drop ratio [0.8]
    -y FLOAT     min overlap drop ratio [0.2]
    -u           disable post join contigs step which may improve N50
    --lowQ       INT
                 output contig regions with >=INT% inconsistency in BED format; 0 to disable [70]
    --b-cov      INT
                 break contigs at positions with <INT-fold coverage; work with '--m-rate'; 0 to disable [0]
    --h-cov      INT
                 break contigs at positions with >INT-fold coverage; work with '--m-rate'; -1 to disable [-1]
    --m-rate     FLOAT
                 break contigs at positions with <=FLOAT*coverage exact overlaps;
                 only work with '--b-cov' or '--h-cov'[0.75]
    --primary    output a primary assembly and an alternate assembly
  Trio-partition:
    -1 FILE      hap1/paternal k-mer dump generated by "yak count" []
    -2 FILE      hap2/maternal k-mer dump generated by "yak count" []
    -c INT       lower bound of the binned k-mer's frequency [2]
    -d INT       upper bound of the binned k-mer's frequency [5]
    -3 FILE      list of hap1/paternal read names []
    -4 FILE      list of hap2/maternal read names []
    --t-occ      INT
                 force remove unitigs with >INT unexpected haplotype-specific reads;
                 ignore graph topology; [60]
  Purge-dups:
    -l INT       purge level. 0: no purging; 1: light; 2/3: aggressive [0 for trio; 3 for unzip]
    -s FLOAT     similarity threshold for duplicate haplotigs [0.75 for -l1/-l2, 0.55 for -l3]
    -O INT       min number of overlapped reads for duplicate haplotigs [1]
    --purge-cov  INT
                 coverage upper bound of Purge-dups [auto]
    --n-hap      INT
                 number of haplotypes [2]
  Hi-C-partition:
    --h1 FILEs   file names of Hi-C R1  [r1_1.fq,r1_2.fq,...]
    --h2 FILEs   file names of Hi-C R2  [r2_1.fq,r2_2.fq,...]
    --seed INT   RNG seed [11]
    --n-weight   INT
                 rounds of reweighting Hi-C links [3]
    --n-perturb  INT
                 rounds of perturbation [10000]
    --f-perturb  FLOAT
                 fraction to flip for perturbation [0.1]

格式轉換

# bam --> fasta
samtools view *.bam | awk '{print ">"$1"\n"$10}' > fasta

#補充一下其他格式的轉換
## sam ---> fasta
cat *.sam | awk '{print ">"$1"\n"$10}' > *.fasta
## fasta ---> sam
bowtie2 -1 *_1.fa -2 *_2.fa -p 16 -x prefix -S *.sam
## sam --> bam
# -@：線程 -b：輸出格式為BAM -S：自動檢測輸入格式 -o：輸出文件
samtools view -@ 16 -b -S final.sam -o final.bam
## bam --> sam
samtools view *.bam -O SAM > *.sam

用途

# 組裝近交/同源基因組（-l0 禁用重復清除功能）
hifiasm -o CHM13.asm -t 32 -l0 CHM13-HiFi.fa.gz 2> CHM13.asm.log

# 利用內置的重復清除功能組裝雜合基因組
hifiasm -o HG002.asm -t 32 HG002-file1.fq.gz HG002-file2.fq.gz

# 用兩個FASTQ文件中的成對端短reads進行 Hi-C 相位分析
hifiasm -o HG002.asm --h1 read1.fq.gz --h2 read2.fq.gz HG002-HiFi.fq.gz

# 雙親二代測序組件 (需要文件 https://github.com/lh3/yak)
yak count -b37 -t16 -o pat.yak <(cat pat_1.fq.gz pat_2.fq.gz) <(cat pat_1.fq.gz pat_2.fq.gz)
yak count -b37 -t16 -o mat.yak <(cat mat_1.fq.gz mat_2.fq.gz) <(cat mat_1.fq.gz mat_2.fq.gz)
hifiasm -o HG002.asm -t 32 -1 pat.yak -2 mat.yak HG002-HiFi.fa.gz

# 使用 HiFi、超長（ont）和 Hi-C reads進行端粒到端粒的單倍體組裝
hifiasm -o HG002.asm --h1 read1.fq.gz --h2 read2.fq.gz --ul ul.fq.gz HG002-HiFi.fq.gz

注意事項

1. no need polish
2. 無需合并多個輸入文件
3. 絕大多數二倍體基因組，只需要組裝2n中的n，所以參數一般給 -l 2 -n 4

只有Hifi數據

• 無需額外的數據類型組裝 HiFi reads

hifiasm -o NA12878.asm -t 32 NA12878.fq.gz#其中NA12878.fq.gz提供輸入reads，-t設置使用中的CPU數,-o輸出文件的前綴名

# no need haplotype
hifiasm --primary -o NA12878.asm -t 32 NA12878.fq.gz

# -l：0:沒有對組裝去冗余，組裝結果包括全部組裝出來的contig，可能包含多個單倍體基因組；2/3:會對組裝出來的基因組進行去冗余，對于二倍體，得到的結果基本上是全基因組一半的大小
# -n: 一般給3或者4，默認3，表示組裝的contig中,unitigs支持大于3或4才保留，該參數會將支持度比較低的contig去掉

使用ONT數據

• Hifiasm 可以集成超長 ONT 讀取來生成端粒到端粒的組裝：

# only ONT
hifiasm -o NA12878.asm -t32 --ul ul.fq.gz HiFi-reads.fq.gz

# + Hi-C
hifiasm -o NA12878.asm -t32 --ul ul.fq.gz --h1 read1.fq.gz --h2 read2.fq.gz HiFi-reads.fq.gz

# + parental
hifiasm -o NA12878.asm -t32 --ul ul.fq.gz -1 pat.yak -2 mat.yak HiFi-reads.fq.gz

使用trio binning組件

• 當有父本的短讀取可用時，hifiasm 還可以通過 trio binning 生成一對單倍型解析的組裝。要進行這樣的組裝，您首先需要使用 yak 對 k-mer 進行計數，然后再進行組裝。

yak count -k31 -b37 -t16 -o pat.yak paternal.fq.gz
yak count -k31 -b37 -t16 -o mat.yak maternal.fq.gz

hifiasm -o NA12878.asm -t 32 -1 pat.yak -2 mat.yak NA12878.fq.gz

也可以通過merqury來確定 k-mer的大小

使用HI-C數據

• 利用成對的端到端 Hi-C reads 生成一對單倍型解析的組裝。

hifiasm -o NA12878.asm -t 32 --h1 read1.fq.gz --h2 read2.fq.gz HiFi-reads.fq.gz
# --h1 --h2 HiC 數據
# -t 線程數
# -o 輸出文件前綴

結果

hifiasm 輸出結果有哪些？

一般來說，用hifiasm組裝基因組，純合材料用- l0，非純系材料，參數-l3，分出兩個單倍型，是默認參數，所以默認可以不設置。
兩個模式大體輸出結果如下圖：

image.png

可以看出來，區別在于前者多輸出了一個a_ctg而后者則多輸出了hap1.p_ctg和hap2.p_ctg
邏輯上，看過文獻應該比較容易理解

image.png

理解共同的輸出文件

r_utg

r 代表 raw，也就是最初組裝出來的原始結果。其中 utg 表示 unitig，或理解為初步組裝且沒有拆分氣泡或者沖突的結果。

image.png

p_utg

p 代表 primary，基本上是在 raw 的基礎上去除掉一些覆蓋率低的連接（或叫氣泡）。看起來簡潔了不少，其實是少了 60000 條邊（當然圖太大，看不太出區別....不過確實是小了四分之一）

image.png

或許高雜合材料里面，覆蓋率低的區域，也可能是另一個單倍型區域？用于后續HiC掛載，可能也要考慮進去。在 p_utg 和 p_ctg 上的選擇，或需要考量。

p_ctg

p 代表 primary，ctg 代表了拆分結果。

image.png

邏輯上 p_ctg 包含了全部單倍型結果（含 hap1 和 hap2）。事實上，這個文件在l0和l3的表現不相同，可以從文件大小看出區別。個人感覺，l0下 p_ctg 約等于 canu 軟件的組裝結果；而l3模式下，p_ctg 比較接近于主要的一套單倍型結果，大體是hap1和hap2中表現最好的每個contig的hap的組合。

a_ctg

a 代表 alternative，大體是拆分出來 p_ctg 之后剩下的就放在 alternative。

hap1/hap2 ctg

亦即兩個單倍型的拆分結果。

假如有 HiC 數據

結果類似。phased的效果會好很多。

對于三重組裝，hifiasm會生成以下文件：

prefix.r_utg.gfa(Haplotype-resolved raw unitig graph in GFA format):保存了所有的單倍型信息。
prefix.hap1.p_ctg.gfa(Phased paternal/haplotype1 contig graph):保留了階段性父系/單倍型1組裝。
prefix.hap2.p_ctg.gfa(Phased maternal/haplotype2 contig graph):保留了階段性母系/單倍型2組裝。

• 獲取組裝結果

# get fasta
awk '/^S/{print ">"$2;print $3}' test.p_ctg.gfa > test.p_ctg.fa

參考

1.Cheng, H., Concepcion, G.T., Feng, X., Zhang, H., Li H. (2021) Haplotype-resolved de novo assembly using phased assembly graphs with hifiasm. Nat Methods, 18:170-175. https://doi.org/10.1038/s41592-020-01056-5

2.Cheng, H., Jarvis, E.D., Fedrigo, O., Koepfli, K.P., Urban, L., Gemmell, N.J., Li, H. (2022) Haplotype-resolved assembly of diploid genomes without parental data. Nature Biotechnology, 40:1332–1335. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01261-x

3.使用hifiasm組裝hifi基因組的方法介紹 作者：生信技術 http://t.csdnimg.cn/UBXEm

4.基因組裝 | hifiasm 輸出結果文件細究 作者：生信石頭基因組裝 | hifiasm 輸出結果文件細究 - 簡書 (jianshu.com)

5.單倍體組裝工具Hifiasm簡介及基本運行命令(一) 作者：呂強強學生信單倍體組裝工具Hifiasm簡介及基本運行命令(一) - 簡書 (jianshu.com)

6.基因組組裝：Hifiasm 使用教程 作者：科學冷凍工廠 基因組組裝：Hifiasm 使用教程-騰訊云開發者社區-騰訊云 (tencent.com)