中大量血液DNA提取的操作步驟有哪些?

操作步驟(請自備:無水乙醇、異丙醇、1.5mL 滅菌離心管、生理鹽水)

1. 取出洗滌液,按終濃度 70%比例加入無水乙醇,如 3mL 加入 7mL 無水乙醇,9mL 加入 21mL 無水乙醇,充分混勻;

2. 取 1.5mL 離心管 1 支,加入 1mL 已經解凍或新鮮的血液(冷藏血液需先輕振混勻后再加入),再加入 70μL 結合液,充分振蕩 15 秒,室溫放置 5 分鐘,13,000rpm 離心 5 分鐘;

3. 徹底吸棄上清,加入 0.8mL 生理鹽水,振蕩至管底沉淀徹底分散,無結塊,13,000rpm 離心 5 分鐘(注意將管蓋、管壁粘附的血跡洗凈);

4. 徹底吸棄上清,加入 0.2mL 生理鹽水,振蕩至管底沉淀徹底分散,無結塊,再加入 180μL 裂解液、20μL 消化液,振蕩混勻,65℃水浴10 分鐘;[注意:如需除去 RNA,可在加入裂解液后先加入 20μL BIOG DNase –Free RNase A(貨號:51006),振蕩混勻,室溫放置 5 分鐘。再加入20μL 消化液,振蕩混勻,65℃水浴 10 分鐘。]

5. 取出離心管,放置到室溫,3,000rpm 離心 30 秒,加入 0.4mL 異丙醇,輕輕顛倒混勻 8 次,如有半透明懸浮物,不影響 DNA 的提取與后續實驗;

6. 將吸附柱放入收集管內,將上述溶液轉入吸附柱內,13,000 rpm 離心 1 分鐘,棄收集管內廢液;

7. 將吸附柱放回收集管內,加 600μL 洗滌液至吸附柱內,靜置 2 分鐘,13,000 rpm 離心 1 分鐘,棄收集管內廢液;

8. 將吸附柱放回收集管內,13,000 rpm 離心 2 分鐘,離去殘留的洗滌液。同時,按每份樣本 40μL 取洗脫液(如 10 份提取樣本,即取 400μL洗脫液),放置于滅菌 1.5mL 離心管,65℃預熱。

9. 取出吸附柱,放入新的 1.5 mL 滅菌離心管內,在吸附柱中心加入 40 μL 預熱洗脫液,靜置 2 分鐘,13,000 rpm 離心 1 分鐘,收集 DNA溶液。提取的 DNA 即可用于下一步實驗或-20℃保存。

注意事項:

1. 裂解液、洗滌液、結合液含有刺激性化學物質,操作過程請做好防護措施,避免直接接觸皮膚,防止吸入口鼻。

2. 洗滌液在使用前應加入乙醇后充分混勻,最好現用現配,每次根據所要提取的樣本量計算后適量配制。

3. BIOG Medi Blood DNAIsolate Kit 設定的標準提取血量為 1mL,客戶如改變提取血量,請同比例增減結合液、裂解液和消化液的使用量,洗滌液的量建議不低于 500μL,洗脫液的量客戶可根據對 DNA 濃度的要求進行選擇,最低可使用 20μL 洗脫液。

4. 裂解液如有白色絮狀物析出屬正?,F象,置于 37℃水浴中溶解即可。

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