前言
今天給大家分享的文獻(xiàn)是2024年3月16日發(fā)表在“Journal of Translational Medicine”的一篇將干濕結(jié)合經(jīng)典的文章，題目是《Single-cell transcriptomic sequencing data reveal aberrant DNA methylation in SMAD3 promoter region in tumor-associated fibroblasts affecting molecular mechanism of radiosensitivity in non-small cell lung cancer》，很適合新手小白訓(xùn)練科研思維！
研究背景：肺癌是全球最流行的癌癥類型，與其他癌癥類型相比，導(dǎo)致的死亡人數(shù)最多。在小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)兩種類型的肺癌中，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率最高，且這類肺癌患者預(yù)后差，5年生存率低。目前肺癌的治療策略包括手術(shù)、放射治療和化療。然而，由于在早期診斷和惡性轉(zhuǎn)移方面的挑戰(zhàn)，肺癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)仍然非常高。輻射抵抗是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)治療中的一個(gè)重要問題，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。
這項(xiàng)研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(6個(gè)數(shù)據(jù)集)中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)來鑒定與非小細(xì)胞肺癌放射治療耐藥相關(guān)的差異表達(dá)基因。作者首先使用GSE37745數(shù)據(jù)集，通過COX回歸和生存分析識(shí)別預(yù)后基因；隨后利用基因集濃縮分析(GSEA)和共表達(dá)分析探討目的基因的功能作用，最后使用UALCAN、DNMIVD和UCSC Xena等數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了基因啟動(dòng)子甲基化水平，而Tisch數(shù)據(jù)庫(kù)提供了對(duì)目標(biāo)基因和CAF之間的相關(guān)性的見解。此外，實(shí)驗(yàn)包括非小細(xì)胞肺癌患者樣本的RT-qPCR、Western印跡和免疫組織化學(xué)，分離的CAF細(xì)胞的體外研究，以及體內(nèi)裸鼠腫瘤模型的研究。最后得出研究結(jié)論：SMAD3在非小細(xì)胞肺癌組織、細(xì)胞和CAF中的高表達(dá)與預(yù)后不良和放療耐藥增加密切相關(guān)。SMAD3可能通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt信號(hào)通路增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的放射抗性。
主要內(nèi)容
一、基于GEO數(shù)據(jù)集，識(shí)別了15個(gè)與非小細(xì)胞肺癌輻射抗性相關(guān)的基因
作者首先從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE2514、GSE18842、GSE21933、GSE31552和GSE44077)中篩選出相比正常對(duì)照組，在非小細(xì)胞肺癌的上調(diào)或下調(diào)的DEG,5個(gè)數(shù)據(jù)集取交集分析后，637個(gè)上調(diào)的DEG和610個(gè)下調(diào)的DEG。鑒于放射抵抗對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者生存的顯著影響，作者對(duì)GSE20549數(shù)據(jù)庫(kù)中的NSCLC細(xì)胞系進(jìn)行了差異分析。作者用|logFC|>1、FDR<0.05和P值<0.05的閾值來確定放射抵抗和放射敏感性。結(jié)果，作者鑒定了2795個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)，包括1574個(gè)上調(diào)的DEG和1221個(gè)下調(diào)的DEG。通過對(duì)NSCLC組織和輻射抗性NSCLC細(xì)胞系中上調(diào)的DEGs進(jìn)行Venn圖分析，獲得了60個(gè)與輻射抗性相關(guān)的基因(圖1A)。之后使用string數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape軟件進(jìn)行了可視化。(圖1B)。節(jié)點(diǎn)DEGree較多的前15個(gè)基因分別為：MCM4、FOXM1、NCAPD2、CDT1、NDC80、HDAC1、KIF2C、MELK、TPX2、HDAC2、SMAD3、HIST1H2BJ、LEF1、FBL和MMP13(圖1C)。
二、SMAD3在CAF中的高表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后不良密切相關(guān)
為了確定所獲得的15個(gè)放射抵抗基因與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，作者對(duì)GSE37745數(shù)據(jù)集進(jìn)行了單因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)SMAD3在非小細(xì)胞肺癌中的預(yù)后價(jià)值最大，是一個(gè)高危基因(圖2A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，上述15個(gè)基因的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，其中SMAD3在臨床組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。(圖2B)。Kaplan-Meier繪圖儀數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果顯示，SMAD3的高表達(dá)與NSCLC患者的總體生存呈負(fù)相關(guān)(圖2C)。此外，免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，SMAD3在非小細(xì)胞肺癌組織中的蛋白表達(dá)上調(diào)(圖2D)。單因素COX回歸分析顯示，SMAD3表達(dá)、腫瘤分期和年齡對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的總體生存有顯著影響(圖2E)。多因素COX回歸分析顯示，SMAD3表達(dá)、腫瘤分期和年齡是影響非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的獨(dú)立因素(圖2F)。根據(jù)這三個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素構(gòu)建了預(yù)測(cè)NSCLC患者生存率的諾模圖(圖2G)，解釋了預(yù)測(cè)的1、2和3年生存率與實(shí)際生存率高度一致(圖2H)。提示SMAD3的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。
CAF已被公認(rèn)為是腫瘤微環(huán)境的主要組成部分，可誘導(dǎo)腫瘤放射抵抗,作者試圖進(jìn)一步驗(yàn)證SMAD3表達(dá)與CAF之間的相關(guān)性。對(duì)來自Tisch數(shù)據(jù)庫(kù)的NSCLC相關(guān)scRNA-seq數(shù)據(jù)集的分析表明，SMAD3高度富含CAF(圖2I)。因此，SMAD3可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素，其高表達(dá)與NSCLC患者的預(yù)后不良相關(guān)。此外，在腫瘤微環(huán)境中，SMAD3在CAF中也有高表達(dá)。
三、SMAD3高表達(dá)與其啟動(dòng)子DNA低甲基化相關(guān)
接下來，作者著手確定SMAD3表達(dá)的失調(diào)是否與其甲基化狀態(tài)的改變有關(guān)。使用UALCAN(圖3A，B)和DNMIVD數(shù)據(jù)庫(kù)(圖3A，B)進(jìn)行分析。肺腺癌(LUAD)和肺鱗癌(LUSC)組織中SMAD3基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平顯著低于正常肺組織。此外，在LUAD和LUSC組織中，SMAD3表達(dá)的增加與SMAD3啟動(dòng)子的低甲基化有關(guān)(圖3E，F(xiàn))。此外，SMAD3啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平SMAD3高表達(dá)組低于SMAD3低表達(dá)組(圖3G，H)。同時(shí)，MSP結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，腫瘤組織中SMAD3啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平降低(圖3I)。因此，SMAD3在非小細(xì)胞肺癌中的高表達(dá)與其啟動(dòng)子低甲基化有關(guān)。
四、SMAD3通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞輻射抗性
隨后，本研究旨在闡明SMAD3在非小細(xì)胞肺癌中的潛在調(diào)控機(jī)制。用GSEA分析SMAD3的功能表明，SMAD3的高表達(dá)與包括NSCLC在內(nèi)的多種癌癥以及與癌癥相關(guān)的通路，如PI3K/Akt/mTOR和KRAS(圖4A，B)有關(guān)。此外，通過差異分析(圖4C，D)，在SMAD3高表達(dá)組和低SMAD3表達(dá)組之間篩選出95個(gè)DEG，其中32個(gè)DEG與SMAD3表達(dá)相關(guān)，Spearman相關(guān)分析(圖4E)顯示。此外，在放射治療相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)GSE20549中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)基因。(圖4F)。其中，ITGA6在輻射抗性組織中高表達(dá)，并與SMAD3的表達(dá)呈正相關(guān)(圖4G)。此外，ITGA6已被證明通過PI3K/Akt信號(hào)通路增強(qiáng)輻射抗性。因此，作者推測(cè)SMAD3可能通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt通路來增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的輻射抗性。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，ITGA6I在腫瘤組織中的表達(dá)增加(圖4H)。Western印跡結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，腫瘤組織中PI3K蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平增加，而總Akt蛋白表達(dá)不變(圖4I)。這些結(jié)果提示SMAD3可能通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt來增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的輻射抗性。
五、CAF中SMAD3啟動(dòng)子區(qū)域DNA低甲基化增加NSCLC細(xì)胞的輻射抗性
上述生物信息學(xué)結(jié)果隨后在體外實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。RT-qPCR結(jié)果顯示，SMAD3在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，其中在H1299細(xì)胞中的表達(dá)最高，在H460細(xì)胞中的表達(dá)最低(圖5A)，因此 H1299和H460細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8結(jié)果顯示，與16HBE細(xì)胞相比，暴露于不同劑量的X射線輻射后，NSCLC細(xì)胞的存活率下降(補(bǔ)充FLE3：圖S3A)，這與SMAD3在細(xì)胞中的表達(dá)一致。結(jié)果表明，SMAD3在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并與輻射抗性有關(guān)。人肺NAF和CAF成功地從新鮮的非小細(xì)胞肺癌和鄰近的正常組織中分離出來(補(bǔ)充FLE3：圖S3B、C)。RT-qPCR和Western印跡結(jié)果顯示，SMAD3在CAF和CAF-CM中的表達(dá)高于NAF和NAF-CM(圖5B，C)。此外，MSP-PCR結(jié)果顯示，與NAF相比，CAF中SMAD3啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平降低(圖5D)。這提示CAF中SMAD3啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化，而SMAD3表達(dá)上調(diào)。
接下來，作者將SMAD3基因?qū)隢SCLC細(xì)胞或在NSCLC細(xì)胞中加入CAF條件培養(yǎng)液(CM)。RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果(圖5E)顯示，OE-SMAD3和CAFS-CM處理的NSCLC細(xì)胞中SMAD3的表達(dá)上調(diào)，而sh-SMAD3(隨后用sh-SMAD3-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn))則下調(diào)。需要注意的是，胞外SMAD3分子并不直接進(jìn)入NSCLC細(xì)胞發(fā)揮其功能。作者推測(cè)SMAD3與NSCLC細(xì)胞膜上的ITGA6結(jié)合。隨后，作者收集細(xì)胞進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)，在CAF-CM組，作者觀察到細(xì)胞裂解物中SMAD3蛋白水平的增加(圖5E)。結(jié)合作者先前發(fā)現(xiàn)的CAFS-CM(圖5C)中SMAD3蛋白含量顯著增加的觀察，以及ITGA6作為一種跨膜黏附受體蛋白，支持作者的假說。此外，除了作為陽性對(duì)照，SMAD3在NSCLC細(xì)胞中的過表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了CAFS-CM誘導(dǎo)的表型結(jié)果的特異性，并排除了CAFS-CM中存在的其他細(xì)胞因子的影響。
用不同強(qiáng)度的輻射作用于NSCLC細(xì)胞，CCK8結(jié)果顯示(圖5F)在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)SMAD3可提高細(xì)胞活力，而沉默SMAD3則導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。進(jìn)一步用6Gy射線處理細(xì)胞，集落形成和Transwell實(shí)驗(yàn)表明(圖5G-H)高表達(dá)SMAD3增強(qiáng)了集落形成和侵襲能力，而沉默SMAD3則相反。用γ-H_2AX免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂。γH_2AX免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在SMAD3高表達(dá)組，γH_2AX熒光強(qiáng)度降低，表明DNA損傷減輕，細(xì)胞凋亡減少。此外，處于G0/G1期的細(xì)胞比例下降，而處于S期和細(xì)胞分裂的細(xì)胞比例增加。當(dāng)SMAD3被沉默時(shí)，TE結(jié)果正好相反?？傊?，CAF中SMAD3啟動(dòng)子區(qū)域的DNA低甲基化可以誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的輻射抗性。
六、CAF中的SMAD3激活了NSCLC細(xì)胞中的ITGA6/PI3K/Akt通路
CAF中SMAD3激活NSCLC細(xì)胞中ITGA6/PI3K/Akt通路的驗(yàn)證是下一個(gè)研究重點(diǎn)。RT-qPCR和Western印跡結(jié)果顯示，與16HBE細(xì)胞相比，NSCLC細(xì)胞ITGA6的mRNA和蛋白的表達(dá)增加，其中H1299細(xì)胞的表達(dá)最高，H460細(xì)胞的表達(dá)最低。此外，PI3K蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平升高，而總Akt蛋白表達(dá)保持不變(圖6A，B)。如圖所示6C、D處理后，OE-SMAD3或CAF-CM可促進(jìn)ITGA6、PI3K蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平，但對(duì)總Akt蛋白表達(dá)無明顯影響。相反，SMAD3沉默導(dǎo)致了相反的結(jié)果，除了總Akt蛋白的表達(dá)沒有變化。總之，CAF來源的SMAD3可以激活NSCLC細(xì)胞中的ITGA6/PI3K/Akt通路。
七、ITGA6/PI3K/Akt通路激活促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞輻射抗性
接下來作者進(jìn)一步在驗(yàn)證ITGA6/PI3K/Akt信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞輻射抗性中的作用。RT-qPCR結(jié)果表明，oe-ITGA6處理的H460細(xì)胞中ITGA6的表達(dá)增強(qiáng)，而H1229細(xì)胞中的sh-ITGA6下調(diào)ITGA6的表達(dá)，其中sh-ITGA6-1的下調(diào)最為明顯(圖7A)，從而用于后續(xù)的檢測(cè)。在圖7B中，除了未受影響的總Akt蛋白表達(dá)外，過表達(dá)ITGA6還增強(qiáng)了PI3K蛋白的表達(dá)和Akt的磷酸化水平，而不改變總Akt蛋白的表達(dá)，但沉默ITGA6還下調(diào)了PI3K蛋白的表達(dá)和Akt的磷酸化水平。這些結(jié)果支持ITGA6正向調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路。此外，在不同劑量的X射線照射下，存在ITGA6過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞活力，而沉默ITGA6則導(dǎo)致相反的結(jié)果(圖7C)。在6GyX射線照射下，ITGA6的過度表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞克隆的形成和侵襲，這一作用被ITGA6的沉默所抵消(圖7D，E)。此外，ITGA6過表達(dá)減弱了γH_2AX熒光強(qiáng)度，減少了DNA損傷、細(xì)胞凋亡和G0/G1期阻滯細(xì)胞，而增加了6GyX射線照射后的S期阻滯細(xì)胞和細(xì)胞分裂；而ITGA6沉默后的結(jié)果則相反(圖7F-H)。
八、CAF來源的SMAD3通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt通路增加NSCLC細(xì)胞的輻射抗性
RT-qPCR和Western印跡結(jié)果顯示，與SMAD3過表達(dá)或CAF-CM單獨(dú)作用相比，經(jīng)sh-ITGA6和oe-SMAD3或sh-ITGA6和CAF-CM共同作用的H460細(xì)胞中，SMAD3表達(dá)和總Akt蛋白表達(dá)無明顯變化，但其ITGA6表達(dá)、PI3K蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平均降低。在sh-SMAD3+oe-ITGA6處理的H1229細(xì)胞中，SMAD3的表達(dá)和總Akt蛋白的表達(dá)沒有變化，而ITGA6的表達(dá)、PI3K蛋白的表達(dá)和Akt的磷酸化水平都有所提高(圖8A，B)。在暴露于不同劑量的X射線照射后，用sh-ITGA6+ oe-SMAD3處理的細(xì)胞活力受到損害，而用sh-SMAD3+ oe-ITGA6處理的細(xì)胞活力則保持不變(圖8C)。此外，經(jīng)6GyX射線照射后，經(jīng)sh-ITGA6+ oe-SMAD3處理后，γH_2AX熒光強(qiáng)度、DNA損傷、細(xì)胞凋亡率和G0/G1期阻滯細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞集落形成和侵襲減少，細(xì)胞分裂明顯受阻(圖8D-H)。綜上所述，CAF來源的SMAD3可通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt通路增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的輻射抗性。
九、CAFS來源的SMAD3在體內(nèi)通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt通路促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)和輻射抵抗
最后，作者進(jìn)一步研究了CAFS來源的SMAD3是否促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的輻射抵抗細(xì)胞內(nèi)通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt通路。如圖所示H460/oe-SMAD3+或H460/CAFS+Gy9A-C組小鼠腫瘤體積和重量增加，H460/ oe -SMAD3+sh-ITGA6+Gy組和H460/CAFS+sh-ITGA6+Gy組小鼠腫瘤體積和重量減小。RT-qPCR和Western印跡結(jié)果顯示，H460/oe-SMAD3+Gyr和H460/CAFS+Gy2組小鼠腫瘤組織中SMAD3、ITGA6、PI3K蛋白的表達(dá)和Akt的磷酸化水平均增強(qiáng)，而總Akt蛋白的表達(dá)無明顯變化。相反，H460/ oe-SMAD3+sh-ITGA6+GY或H460/CAFS+sh-ITGA6+GY的結(jié)果與未改變Akt蛋白表達(dá)的結(jié)果相反(圖9D，E)。此外，圖9F，G中所示的數(shù)據(jù)解釋了H460/ oe-SMAD3+GY或H460/CAFS+GY反應(yīng)中Ki67陽性腫瘤細(xì)胞的高百分比和低細(xì)胞凋亡率。而H460/ oe-SMAD3+sh-ITGA6+GY或H460/CAFS+sh-ITGA6+GY則逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。
綜上所述，上述結(jié)果表明，CAF來源的SMAD3可能通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt通路，促進(jìn)NSCLC腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)，增強(qiáng)腫瘤的放射抗性。
文章機(jī)制圖：
SMAD3在CAF中顯著高表達(dá)，其很可能可能通過激活I(lǐng)TGA6/PI3K/Akt通路，從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的輻射抗性
Majic有話說
這篇文章雖然題目里面涉及單細(xì)胞，但是文章內(nèi)容單細(xì)胞分析并不多，大部分是轉(zhuǎn)錄組bulk RNA-seq分析，如果進(jìn)一步進(jìn)行單細(xì)胞高級(jí)分析:細(xì)胞通訊分析，擬時(shí)序分析等，可能文章會(huì)更出彩。但是文章基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)很扎實(shí)，做了很多工作，特別是根據(jù)某一個(gè)特點(diǎn)的科學(xué)問題系統(tǒng)篩選出關(guān)鍵基因，最后再通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證的思路值得我們學(xué)習(xí)。但是Majic讀下來感覺在SMAD3在腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞之間的關(guān)系講的也不是很透徹，當(dāng)然作者可能做了沒有拿到好的結(jié)果，抑或是作者沒有條件做更深入的功能性實(shí)驗(yàn)。
不過，這篇干濕結(jié)合的方法值得我們學(xué)習(xí)借鑒！各位客官，今日分解到此結(jié)束，咱們下回見！關(guān)于文獻(xiàn)中涉及的問題歡迎后臺(tái)或者評(píng)論區(qū)留言！
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