本文選自Developmental Cell，https://doi.org/10.1016/j.devcel.2019.04.011，喜歡的朋友可以自行下載閱讀。

大神的綜述，趕緊膜拜一下。David Lyden

摘要：轉移是腫瘤發展的關鍵階段，是治療癌癥的主要挑戰，也是癌癥死亡的主要原因。原發性腫瘤細胞與遠處器官微環境之間通過胞外小泡（胞外小體和微泡）進行細胞間通訊是轉移前生態位（PMN）形成和轉移的關鍵。在此，我們綜述了外泌體在腫瘤進展中的作用，外泌體在PMN建立中的作用，以及外泌體在器官向性轉移中的作用。我們也描述了外泌體的臨床應用。

背景：外泌體是由大多數細胞分泌的納米大小的囊泡（直徑30-150納米）。它們被脂質雙層包圍，攜帶各種生物分子，包括蛋白質、聚糖、脂類、代謝物、RNA和DNA。當外泌體被其他細胞吸收時，這些物質被轉移并影響受體細胞的表型。因此，外泌體被認為是細胞-細胞通訊的重要介質。外體生物發生起源于內吞途徑。它開始于內胚體限制膜的內陷，導致內囊泡的形成。這個被稱為多泡體（MVB）的小室與質膜融合，最終以胞外體的形式釋放ilv。外泌體的形成需要細胞內多個蛋白質網絡的協同作用。其中包括（1）Rab-GTPase蛋白，控制內質體運輸；（2）轉運所需的內體分選復合物（ESCRT），它由調節ILV形成的多種蛋白復合物組成；（3）四肽是一種跨膜蛋白，可誘導膜曲率，從而形成囊泡；以及（4）各種脂類修飾酶，例如產生促進小泡形成的神經酰胺。值得注意的是，這些因素中的許多直接與外泌體物質相互作用，這表明囊泡的形成是一個復雜的調節過程，它與決定用于外體分泌的底物的選擇性隔離緊密相關。除了經典描述的外泌體，外顯體群體中也存在異質性，亞群可分為三類：Exo-Large (90–120 nm), Exo-Small (60–80 nm), and the membrane-less exomere(<50nm)。每一個亞型在其大分子組成方面都表現出獨特的特性，進一步突出了外泌體生物發生機制的特異性和選擇性。由于外泌體不是膜結合的，因此更像是粒子而不是囊泡，因此可以認為外泌體不僅包括小的細胞外囊泡（EV），而且還包括其他細胞內衍生的蛋白質、核酸和脂質的分泌復合物。

除了外泌體，細胞產生其他類型的ev，包括通過直接質膜芽生形成的微泡（mv），被認為比胞外體大，大小從100到1000nm不等。因此，外泌體和MVs之間的兩個重要區別包括生物發生的位置和大小。和葉綠體一樣，MVs攜帶多種生物活性因子，包括蛋白質和核酸。MV芽接的初始過程依賴于肌動蛋白聚合，發生在富含神經酰胺、膽固醇和細胞外磷脂酰絲氨酸的質膜脂質域，這些區域共同促進了膜的彎曲和出芽。MVs從細胞表面的斷開受小GTPase ADP核糖基化因子6（ARF6）誘導的肌球蛋白收縮性調節，并且ESCRT也參與了MV脫落的最后階段。ARF6還可以在外泌體生物發生過程中調節ILV萌生到MVBs中。因此，除了目前定義的細胞起源、大小和生物發生的特定方面的區別外，MV形成和外泌體生物發生還采用了常見的蛋白質機制。

細胞間通訊是腫瘤進展和轉移的重要特征。值得注意的是，除了原發性腫瘤微環境中的局部信號外，腫瘤還可以遠距離向未來轉移的部位發出信號，以促進形成一個適宜的、轉移前的生態位（PMN），在腫瘤細胞到達后促進其生長。由于外泌體可以運輸和轉移生物活性分子，因此外泌體在調節轉移方面的能力目前受到極大關注。事實上，通過耗盡腫瘤細胞中的Rab27a或藥物抑制未來轉移部位的外體攝取而減少外泌體分泌足以損害PMN的形成以及腫瘤轉移的發生。

值得注意的是，MVs在癌癥期間參與細胞串擾；最早的研究之一描述了來自轉移性黑色素瘤細胞的MVs如何增強侵襲性較弱的非轉移性黑色素瘤細胞的肺定植。關于MVs的進一步研究主要強調了MVs支持原發性腫瘤生長和生存的能力。在這里，我們把重點放在外泌體上，因為根據其歷史定義的大小標準和細胞起源，以及它們包括不是真正的囊泡的分泌顆粒，它們被描述為在PMN形成和轉移過程中介導長程信號的主要EV群體。我們回顧了外泌體在腫瘤轉移中的作用的研究進展，重點介紹了外泌體在腫瘤轉移中的作用，外泌體在PMN形成中的作用，以及外泌體的臨床應用

外泌體內的腫瘤信息。

包裹中的蛋白質

癌細胞外泌體包含多種蛋白質，有些在不同的細胞類型之間共享，而另一些則是獨特的包裝，反映了原始細胞。腫瘤外泌體表達一系列蛋白質，包括致癌蛋白、整合素和信號分子。對癌細胞外泌體的分析發現，蛋白質的外體包裝在不同的癌癥類型之間以及不同轉移潛能但來源相似的癌癥之間存在差異。來自美國國家癌癥研究所（NCI-60）的代表9種不同癌癥類型的60種癌細胞系的EV的蛋白質組學特征發現，這些癌癥的EV中只有213種蛋白質是共享的，而總體而言，超過6000種蛋白質是唯一的。共有的蛋白質代表了參與生物發生的因素，而獨特的蛋白質則反映了細胞的起源，而這些細胞又是潛在的標記物。其他研究對胰腺癌（PaC）進行了全面的蛋白質組學分析外泌體。外泌體的特征從人PaC和非惡性胰腺上皮細胞系的蛋白質組中發現362種蛋白在PaC外泌體中特異表達，已知其在PMN調節和腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移中的作用。同樣，在兩個具有不同轉移潛能的PaC細胞系的外泌體中發現了4000多個蛋白表達。然而，其中79種差異表達，在更高轉移性細胞系的外泌體中發現的蛋白質在粘附、侵襲、生長、代謝和轉移中發揮作用。同樣，轉移性小鼠黑色素瘤細胞系B16F10的外泌體與侵襲性較小的小鼠黑色素瘤變體B16F1相比，具有更高的cMet水平。在這些研究中，來自更具侵襲性的細胞系的外泌體比來自轉移性較小的變體的外泌體更具轉移性，提示這些獨特的外體蛋白表達模式影響轉移的進展。

差異和選擇性的蛋白質包裝也發生在不同來源的癌癥和具有特定轉移傾向的癌癥之間。不同類型腫瘤外泌體中不同整合素的包裝對決定攜帶腫瘤外泌體的器官有一定作用。a6b4和a6b1整合素在轉移到肺的乳腺癌（BC）外泌體中最為豐富，而avb5整合素在肝轉移（肝向）PaC外泌體中富集。有趣的是，這種外泌體整合素表達模式并不代表細胞整合素的表達，這表明特定的包裝途徑促進了這些整合素優先排序為外泌體。具體來說，a6b4在肺轉移細胞的外泌體中的表達高于細胞本身的表達水平。此外，盡管肝轉移細胞的a6b4表達高于肺轉移細胞，但來自肺嗜性細胞的外泌體比來自嗜肝細胞的外泌體包裹更多的a6b4。這些外泌體顯示的攝取模式反映了腫瘤細胞的轉移性器官向性，并依賴于這些整合素，這表明腫瘤分泌的外泌體整合素在決定腫瘤轉移的部位起著至關重要的作用，它們可以作為預測器官向性轉移的生物標志物。同樣，在胃癌（GC）中，整合素avb6通過外泌體在腫瘤細胞之間轉移，增強受體細胞的粘附和遷移。此外，在前列腺癌患者中，整合素avb6在外周血單個核細胞中高表達。avb6整合素抑制腫瘤細胞及其外泌體的STAT1/MX1/2信號轉導，當通過外泌體轉移時，重組單核細胞為M2腫瘤支持表型。

在腫瘤細胞上表達的表皮生長因子受體（EGFR）在腫瘤的發生中起著重要作用，而EVs介導的EGFR信號也被描述為支持腫瘤的進展和轉移。早期關于分泌型EGFR在原發性腫瘤發生過程中的作用的研究表明，腫瘤細胞源性MVs向其他腫瘤細胞或內皮細胞（ECs）水平轉移癌基因EGFR可促進膠質瘤中癌細胞的生長和存活以及誘導人鱗狀細胞癌血管生成。GC外泌體也表達功能活性的EGFR，可以被傳遞到肝間質細胞的質膜上。EGFR從細胞膜轉位，激活HGF，HGF與癌細胞上的cMet結合，促進轉移細胞的種植和增殖。EGFR配體也可以通過外泌體轉移，促進轉移。Amphiregulin是一種EGFR配體，在人類BC和結腸癌（CoC）外泌體中被發現，并增加了周圍癌細胞的侵襲性。在CoC中，EGFR和Amphiregulin均在患者血漿外顯體中表達。

podoplanin（PDPN）是一種跨膜糖蛋白，在腫瘤組織中表達增高。表達高PDPN的細胞分泌更多的外泌體，這些外泌體包含與細胞粘附、細胞骨架重塑、信號轉導、細胞內轉運和EV生物發生有關的蛋白質。PDPN本身在外泌體膜上表達，提示糖蛋白在調節外泌體生物發生和貨物選擇中有著重要但鮮為人知的作用。

一些細胞的外泌體亞群之間的異質性也顯示出來。Exo-Large (90–120 nm), Exo-Small (60–80 nm), and the membrane-less exomere(<50nm)三個亞群分別選擇性地包裝了與不同細胞途徑和不同細胞器相關的獨特蛋白質。當外謎體顯著富含與代謝和聚糖生物學相關的蛋白質時，較大的外顯子高度表達annexins、ESCRTs、integrins和信號通路分子。對外泌體釋放和支持原發性腫瘤生長和轉移至關重要的Rab蛋白主要在外泌體大和外泌體小表達，而不是membrane-less exomere。這些蛋白質表達模式表明，每種亞型在癌癥中都有不同的作用。

Nucleic Acid Parcels

外泌體也含有多種rna。大多數研究表明，microRNAs（miRs）和非編碼RNAs是外泌體運輸的主要RNA物種；然而，也有報告稱存在mRNA、rRNA和tRNA。不同的外泌體亞群含有不同數量的RNA，但一般來說，較大的囊泡含有更多的RNA。外泌體RNA介導細胞間的通訊，包括在腫瘤微環境中培養不同的細胞，并顯示其作為癌癥生物標記物的潛力（表1）。例如，在PrC，外源性miRs誘導成纖維細胞活化、遷移、血管生成和成骨細胞分化，從而促進骨PMN。來自CoC細胞的外體miR-1245通過高轉化生長因子b（TGF-b）表達將巨噬細胞重編程為腫瘤相關巨噬細胞（TAM），從而促進腫瘤生長和轉移。外泌體miRs也促進了轉移生態位（MN）。在大腦中，星形膠質細胞的外泌體將miR-19a轉移到BC細胞，導致PTEN表達減少，從而導致CCL2的分泌和髓樣細胞的募集，增強增殖，最終增加腦轉移。這些研究闡明了外源性miRs在調節癌癥進展中的不同作用。

雖然外體miRs的研究最好，但其他外體rna的功能也受到了質疑。卵巢癌（OvC）外泌體向間皮細胞轉移MMP1 mRNA在體外和體內誘導腹膜間皮屏障的破壞并促進癌癥擴散。另一種RNA損傷相關分子模式（DAMP）轉移的機制最近被揭示。在非病理條件下，RN7SL1在成纖維細胞胞漿中被三結合蛋白SRP9/14屏蔽。然而，在BC中，腫瘤細胞激活了癌成纖維細胞的Notch-Myc通路，在外泌體中部署了非屏蔽的RN7SL1。非屏蔽的RN7SL1激活RIG-I，在轉移到免疫細胞時產生炎癥反應，當轉移到BC細胞時誘導腫瘤生長和侵襲。

通過外泌體轉移RNA也可以從癌細胞中去除腫瘤抑制分子。在CoC中，腫瘤抑制mir被高度包裝成外泌體，而致癌mir在細胞中的表達高于外泌體。外顯子介導的細胞miR再平衡有利于原發性腫瘤的進展。

DNA首先在外泌體中被發現為單鏈DNA（ssDNA）。后來，雙鏈DNA（dsDNA）被發現是外泌體中DNA的主要形式位于囊泡的表面和內部。外體DNA（exoDNA）來源于細胞核和線粒體（mtDNA），代表整個基因組，不偏向特定序列或DNA結構。與非癌細胞的外泌體相比，癌源性外泌體的DNA包裝顯著更高。此外，在所有外泌體亞群中都發現了DNA，但不同癌細胞系之間的分布有所不同。雖然外泌體DNA包裝的機制尚不明確，但有研究表明，小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）利用外泌體去除多余的細胞質DNA（cytDNA），這可能會導致細胞周期停滯或凋亡等衰老。鑒于高水平的基因組不穩定性和cytDNA在癌細胞中的積累，癌細胞可能分泌更多的外泌體DNA以防止衰老和凋亡，確保其生存和增殖潛力。

雖然，很明顯癌源性外泌體含有更多的DNA，但是外泌體DNA攝取的功能效應尚不清楚。腫瘤源性外泌體DNA的作用主要是在化療或放療的背景下研究的。例如，用拓撲替康或輻射誘導的免疫刺激性DNA分泌治療患有BC腫瘤的小鼠，通過促進樹突狀細胞（DC）成熟和CD8+T細胞活化而導致抗腫瘤反應。此外，用伊立替康處理CoC細胞后，可誘導含DNA外泌體的釋放。當該外顯DNA被腸道固有免疫細胞攝取后，激活炎癥小體，誘導IL-1b和IL-18分泌，并產生嚴重的胃腸道毒性。最后，許多癌癥的特征是線粒體DNA的丟失，導致對無氧代謝和休眠的依賴性增加。在激素治療敏感的BC模型中，癌相關成纖維細胞（CAFs）在其外泌體中包裝了大量的mtDNA。獲得這種mtDNA的休眠癌干細胞（CSCs）退出代謝停滯，并有助于轉化為激素治療耐藥疾病。

如前所述，外泌體DNA代表整個基因組；因此，任何突變都可能在外謎體DNA中發現。因此，從患者血漿中提取的外泌體DNA可用于癌癥特異性突變的早期檢測。事實上，一些報告顯示PaC循環的外泌體可以作為KRAS和TP53等基因中癌癥突變的液體活檢。此外，外泌體DNA突變頻率和預后不良相關

外泌體塑造PMNs：從基礎到最終構建

PMN是由遠處器官發生的變化引起的，這些變化是為循環腫瘤細胞（ctc）的種植和生長準備的。在PMN模型中，關于轉移病灶生長的器官的決定不是隨機的，而是由原發性腫瘤分泌因子啟動和協調的預定過程。此外，最近的數學模型表明，有兩個因素對PMN的形成和轉移至關重要：（1）促進轉移突變的發生；（2）適宜的環境。沒有后者，入侵是不可能的，因為競爭性淘汰和缺乏潛在的生態位。

共同構成腫瘤的分泌因子和分泌因子。這些分泌因子以特定器官為靶點，誘導改變，為ctc創造一個良好的環境。雖然沒有直接比較每種因素的相對貢獻，但在小鼠黑色素瘤和大鼠PaC已經證明用從這些細胞的條件培養基中分離出的外泌體進行體內治療足以重現條件培養基處理觀察到的PMN誘導。在這里，我們特別關注外泌體如何調控信息，但我們指導讀者閱讀其他關于PMN形成的評論，這些評論涵蓋了在此過程中額外分泌因子的重要作用。對于未來的工作來說，更好地剖析腫瘤分泌組分是如何協同調節PMN的，這無疑是至關重要的。這些PMN變化包括血栓形成、血管滲漏、骨髓免疫細胞浸潤、細胞外基質（ECM）和基質調節。

血栓形成：血凝塊變厚

癌癥患者發生血栓的風險增加，這是預后不良的主要原因。第一個證據表明，在豚鼠肝癌細胞系和小鼠BC細胞系脫落的微粒中，促凝活性得到證實。從那時起，一些研究表明，腫瘤衍生的EVs表現出促凝特性，這可能有助于腫瘤相關血栓形成，而血栓形成往往與轉移相關。組織因子（TF）是一種跨膜受體，也是凝血的起始因子，在腫瘤源性外泌體和MVs中的富集與血栓形成的增加有關。TF結合凝血蛋白，引發一系列事件，導致纖維蛋白凝塊的形成和血小板活化。在MDA-MB-231bc模型中，與來自非轉移MCF7-BC細胞的EVs相比，外泌體和MVs在TF中富集并加速凝血，這表明TF相關的侵襲性表型。通過MDA-MB-231MVs將TF轉移到MCF7細胞顯著提高MCF7細胞中的TF活性。MDA-MB-231外泌體通過TF依賴性凝血酶的生成促進血漿凝血和間接血小板聚集，但它們也直接與血小板相互作用并獨立于TF激活血小板。此外，來自髓母細胞瘤細胞系和兒童胚胎性腦腫瘤的miR-520外泌體直接靶向并降低TF，減少纖維蛋白凝塊。

外泌體也通過其他因素或間接影響凝血而誘發血栓形成。黑色素瘤外泌體和MVs富含組蛋白和熱休克蛋白，可增強血小板血漿中凝血酶的生成?；罨“錗Vs（PMVs）還通過促進MAPK和PI3K-Akt信號傳導，支持癌細胞向肺癌細胞轉移后的增殖和轉移，MMP表達上調，癌細胞粘附到內皮細胞和纖維蛋白原，表明這些凝血相關的途徑也支持癌癥進展的其他方面。事實上，用肝素（一種抗凝藥物）反復治療口腔鱗癌細胞，可抑制體泌外轉移表型并降低體內腫瘤生長。此外，外泌體誘導中性粒細胞胞外陷阱（NETs）的形成，這一過程增強了癌癥相關的血栓形成。net誘導血小板聚集和凝血抑制劑降解。在體內，表達TF的4T1小鼠BC外泌體誘導NET形成和加速血栓形成。在4T1荷瘤動物中觀察到類似的NET誘導和血栓形成，這表明外泌體是參與NET依賴性血栓形成的一個關鍵的腫瘤誘導因子。

血管破裂和滲漏

血管內皮細胞層為液體、蛋白質和細胞提供了物理屏障。內皮細胞之間通過粘附物和緊密連接連接連接，而這些連接又保持內皮屏障功能。評估遠處組織發現，癌細胞分泌的可溶性因子和外泌體能夠損傷EC連接，這反過來又導致血管通透性增加，使囊泡和細胞進一步進入組織實質。在BC中，多個研究表明外源性miRs誘導血管通透性。MiR-939在bc患者腫瘤中高表達，并通過外泌體轉移到ECs，導致血管內皮（VE）-鈣粘蛋白（EC特異性粘附蛋白）下調，增加體外血管通透性。在小鼠體內，miR-181c通過下調肌動蛋白調節因子PDPK1，破壞血腦屏障（BBB）的穩定性，導致ECs中肌動蛋白定位異常。這擾亂了肌動蛋白與緊密連接蛋白的結合，增加了血管通透性和腦轉移。同樣，外泌體miR105通過下調另一種緊密連接蛋白ZO-1，誘導肺和肝血管滲漏，促進轉移，從而破壞緊密連接。MiR-105在轉移前階段的患者循環中檢測到，血液和腫瘤中的MiR-105水平與BC早期的轉移進展相關。在多形性膠質母細胞瘤（GBM）患者中，來自GBM干細胞樣細胞的外泌體含有高水平的功能性VEGF-A，可在體外誘導腦內皮細胞的血管生成和通透性?？偟膩碚f，這些研究展示了外泌體是如何利用各種機制促進不同癌癥轉移部位的血管滲漏。

免疫功能阻滯

由自然殺傷細胞（NK）和T細胞等免疫細胞介導的抗腫瘤免疫是一種天然的抗腫瘤免疫。為了克服這一障礙，腫瘤細胞在轉移部位參與免疫抑制機制，包括招募其他免疫細胞來抑制這些抗腫瘤反應。免疫細胞的募集是PMN建立的一個標志，這些細胞已經被證明具有免疫抑制能力。尤其是，PMN形成的一個關鍵始發事件涉及骨髓中造血干細胞和祖細胞的擴張以及這些細胞動員到PMN，在PMN中，這些細胞被重新編程為免疫抑制性髓系，從而阻斷T細胞介導的抗腫瘤免疫。有趣的是，外泌體誘導骨髓源性細胞（BMDC）向肺中性粒細胞（PMN）募集，它們還促進骨髓源性抑制細胞的積聚，并直接抑制缺乏腫瘤小鼠肺和肝臟中的T細胞和NK細胞。成熟的樹突狀細胞也通過呈遞腫瘤抗原在抗腫瘤免疫中發揮重要作用，但黑色素瘤衍生的外泌體損害淋巴結（LNs）中的DC成熟。由于淋巴結轉移是黑色素瘤向全身轉移疾病發展的關鍵，這些結果說明了外泌體介導的免疫抑制在轉移過程中的重要性。

分子水平上，外泌體介導的免疫調節機制多種多樣。B16F10黑色素瘤外泌體將活化的cMet轉移至BMDC，以促進促轉移表型并動員PMN。黑色素瘤外泌體還通過外泌體PD-L1介導免疫抑制，抑制CD8+T細胞功能，促進腫瘤生長。重要的是，循環外泌體PD-L1水平與黑色素瘤患者的轉移呈正相關，這表明外泌體介導的免疫抑制機制在促進轉移中起著重要作用。B16F10黑色素瘤外泌體含有小核RNA，可激活肺上皮細胞中TLR3的表達，這對于中性粒細胞募集到肺中形成PMN至關重要。在GC模型中，表達高遷移率族盒-1（HMGB1）的外泌體通過與中性粒細胞TLR4受體結合來激活中性粒細胞。雖然中性粒細胞活化對中性粒細胞形成的影響在本研究中沒有被研究，但這些中性粒細胞也可能影響中性粒細胞，如黑色素瘤。在PaC模型中，外泌體壓迫任何腫瘤-特異性抗原這些外泌體結合自身抗體進入血漿，形成補體機制的誘餌，并阻止針對癌細胞自身的免疫反應。相反，來自非轉移性癌細胞的胞外泌體促進TRAIL陽性腫瘤反應性巨噬細胞的擴張、募集和分化，這些巨噬細胞殺死并吞噬腫瘤細胞，有助于減少轉移。

Educating the Neighborhood

當腫瘤形成時，它們通過可溶性因子、外泌體和直接的細胞-細胞相互作用來改變間質。此外，遠端器官中的bmdc和成纖維細胞是原發性腫瘤外泌體的共同靶點。除了促進成纖維細胞活化，外泌體還通過體外對人成纖維細胞進行代謝重編程，誘導細胞外酸化，這是PMN建立的重要步驟。多發性骨髓瘤（MM）細胞修飾bmdc以創造腫瘤支持環境。然后，修飾的BMDC分泌外泌體，誘導MM腫瘤生長并促進腫瘤細胞的擴散。同樣，來自BMDC外泌體的miR-221促進GC細胞遷移、侵襲和基質粘附。黑色素瘤外泌體增強自身的攝取。原發性腫瘤CAFs的外泌體也影響轉移。在BC模型中，CAF外泌體增加癌細胞的運動性、遷移性和侵襲性，這依賴于Wnt信號。此外，CAF來源的miRs外泌體的轉移促進了BC細胞的非錨定細胞生長、侵襲性和骨轉移。

細胞外基質改變

在PMN建立過程中，ECM通過重組已有的分子或通過新的ECM沉積而改變。這些變化受到許多因素的推動，包括可溶性因子、免疫細胞和外泌體，從而為CTC的播種和生長創造了一個寬松的環境。癌源性外泌體調控ECM，外泌體誘導的肝、肺中性粒細胞纖維結合蛋白沉積被描述。在肝臟中，攜帶巨噬細胞移動抑制因子（MIF）的PaC外泌體促進Kupffer細胞分泌TGF-b，從而誘導星狀細胞產生纖維連接蛋白。同樣，肺成纖維細胞攝取BC外泌體促進其活化和纖維結合蛋白分泌。此外，外泌體小核RNA增強了肺pmn中MMP9和纖維連接蛋白的表達，從而促進中性粒細胞的募集。在大鼠PaC模型中，由于細胞外基質降解缺陷，外泌體中CD151和Tspan8（屬于四斯潘蛋白家族）的耗竭會削弱外泌體介導的PMN形成，從而導致轉移減少。暴露于缺氧條件下的PrC細胞分泌富含細胞-細胞連接重構酶的外泌體，導致這些外泌體靶向的PrC細胞的運動性、侵襲性和干性增加。來自高轉移性卵巢癌細胞的EVs攜帶MMP1 mRNA，轉移到間皮細胞，MMP1的表達和分泌反過來上調以促進癌癥的進展。最后，非小細胞肺癌（NSCLC）細胞調節胞外泌體中podocalyxin的表達，進而影響成纖維細胞中整合素的運輸，并通過引入促腫瘤的ECM成分創造一個支持腫瘤細胞遷移和侵襲的微環境。

器官轉移之謎

盡管提出了器官靶向性的概念，描述了某些腫瘤轉移到特定器官的傾向，最初是由斯蒂芬·佩吉特在120多年前提出的，但轉移的這一方面的機制仍不清楚。最近關于外泌體介導的轉移的研究部分地解決了這個謎團。腫瘤源性外泌體表達特定整合素模式，即a6b1、a6b4、avb5和avb3，與ECM分子（如層粘連蛋白和纖維連接蛋白）以及靶器官中的某些細胞類型有關，部分決定了肺、肝和腦器官變性部位的未來PMN。此外，在囊泡表面發現的額外外泌體粘附分子和其他外泌體成分，如脂質，也可能介導外泌體在未來轉移部位的選擇性粘附和細胞融合，從而促進器官向性。關于外泌體在促進轉移中的作用的研究也表明，并非所有的小生境都是一樣的，肺、肝、骨和LN-pmn表現出獨特的特征。關鍵的是，在體內觀察到了EVs從腫瘤轉移到轉移部位（如肺和LN）的系統性轉移，這為腫瘤衍生EVs長距離發出信號的能力提供了直接證據。外泌體誘導遠處、未來轉移部位微環境發生明顯變化的能力證實了它們在調節器官向性轉移中的作用。

肺、肝、骨和腦：固定的niche

對肺轉移的研究闡明了外泌體介導的PMN形成的定義原則，包括免疫細胞的招募、常駐細胞的培養和間質的改變。對PMN形成的初步描述表明，表達血管內皮生長因子受體1（VEGFR1）的bmdc在癌細胞到達之前就已經回到肺部。這些細胞與局部間質相互作用，并為將來的轉移細胞產生接受位點。后續研究表明，原發性腫瘤驅動的外泌體是這一過程的關鍵介體。表達cMet的黑色素瘤外泌體被bmdc直接吸收，促進其向肺部的浸潤，從而形成以血管滲漏為特征的PMN并促進轉移。除了遷移性免疫細胞募集到肺部外，外泌體直接靶向肺部以誘導BC模型中的血管滲漏，并調節BC和黑色素瘤中的常駐肺成纖維細胞和上皮細胞。這種外泌體的攝取需要在外泌體中表達層粘連蛋白結合整合素a6b4和a6b1，并且外泌體a6b4還通過促進S100基因表達和Src信號通路支持成纖維細胞活化。在上皮細胞中，黑色素瘤外泌體攜帶的小核RNA激活TLR3受體，導致向肺PMN募集促轉移中性粒細胞。其他研究表明，BC外泌體靶向ECs和下調的細胞-細胞連接蛋白，以促進血管滲漏。BC外泌體Annexin II（AnxII）上調肺間質中pSTAT3和p38MAPK-NF-kB信號通路也與肺轉移增強有關。總之，這些關于肺PMN形成的研究表明，外泌體通過靶向不同的細胞類型，誘導多個間質修飾，激活各種促轉移的信號傳導過程來誘導PMN，所有這些都結合起來創造一個有利于腫瘤細胞定植的環境。

肝轉移比原發性肝癌更常見，在許多類型的癌癥中都有發現，尤其是胃腸道、乳腺、肺和胰腺，并且與生存率低有關。與肺PMN形成不同，表達整合素avb5的PaC外泌體通過與肝臟中富含纖維連接蛋白的ECM結合而促進肝器官向性，主要由成熟的駐留巨噬細胞（稱為Kupffer細胞）攝取，以促進肝轉移。Kupffer細胞的這種外泌體攝取通過隨后激活肝星狀細胞導致肝轉移增強，后者分泌纖維連接蛋白以促進BM源性巨噬細胞的募集，并且需要外泌體MIF參與。額外的研究支持了這些發現，證明PaC外泌體不僅被Kupffer細胞所占據，而且還存在于其他巨噬細胞群中，這些巨噬細胞群組織成轉移前簇并促進轉移。類似地，巨噬細胞攜帶miR-21的外泌體與TLR7結合并誘導肝巨噬細胞極化?；罨木奘杉毎S后分泌炎性細胞因子，如IL-6和S100A家族成員，支持肝轉移。我們目前對肝臟PMN形成的理解強調巨噬細胞是負責接收和傳遞腫瘤外泌體信息以促進肝器官向性轉移的關鍵角色。

骨是許多實體瘤的首選轉移部位，發生在癌癥的晚期。而在肺轉移和肝轉移中，外泌體通過免疫細胞和基質細胞發揮作用；在骨中，外泌體主要調節局部基質細胞、破骨細胞和成骨細胞。骨轉移性病變分為溶骨性病變和成骨細胞性病變，前者可導致骨破壞，后者可增加骨產量。它們也可能是由于破骨細胞和成骨細胞功能之間的平衡失調造成的。非小細胞肺癌（NSCLC）是一種溶骨性癌，血漿外泌體高度表達Amphiregulin，它結合并持續激活破骨細胞中的EGFR。這導致蛋白水解酶表達增加，破骨細胞發生，并通過RANKL上調激活破骨細胞轉移。L-plastin是一種參與細胞侵襲的肌動蛋白結合蛋白，通過MDA-MB231外泌體轉移至破骨細胞，并通過RANK在體內誘導骨溶解。在MM中，外泌體調節破骨細胞前的遷移和破骨細胞分化，其特征是通過激活CXCR4途徑升高破骨細胞標記物。相反，來自成骨細胞PrC的外泌體被轉移到破骨細胞前體細胞，導致破骨細胞前體細胞增殖和分化的降低，以及破骨細胞分化標記物的減少。此外，來自PrC的miR-141-3p外泌體通過降低DLC1的表達促進成骨細胞活性、腫瘤生長和轉移。此外，miR-940在成骨細胞癌的外泌體中高表達。miR-940體外轉染骨髓間充質干細胞促進成骨轉移。

腦轉移目前還不清楚，腫瘤外泌體在介導腦PMN形成和轉移中的作用尚不清楚。重要的是，表達avb3整合素（而不是其他有利于肝和肺器官向性的整合素）的腦向性外泌體被證明與大腦內皮細胞融合。不同的研究表明，來自BC的外泌體通過損傷ECs中的細胞-細胞連接蛋白ZO-1，從而導致BBB通透性增加以及通過外泌體Anx II激活腦間質中的p-STAT3和磷酸化p38-NF-kB。在另一項研究中，星形膠質細胞衍生的外泌體誘導腫瘤細胞發生癌變，從而增加腦轉移。雖然外泌體介導的轉移在其他器官中已經出現，但是關于大腦的研究還有很多需要了解。有一個未被滿足的臨床需求證明了進一步研究外泌體在腫瘤轉移中的作用，特別是對于小細胞肺癌、BC和黑色素瘤的患者。

免疫介質： Traveling Niches

腫瘤分泌因子，包括外泌體，通過影響免疫系統和調節淋巴管生成在轉移中起著關鍵作用。此外，淋巴器官的轉移發生在許多類型的癌癥中，通常是轉移到其他器官之前的一個短暫的部位。外泌體介導轉移的最早特征之一表明，B16F10黑色素瘤外泌體通過增加與血管生成、ECM調節、腫瘤細胞募集和生長相關的基因的表達促進PMN的形成。最近對黑色素瘤的研究表明，B16F10外泌體被肩胛下竇（SCS）169+巨噬細胞吞噬。正常情況下，SCS-169+巨噬細胞對腫瘤有抑制作用，可作為一種屏障阻止外泌體的傳播。然而，在腫瘤進展過程中，這種屏障被破壞，使外泌體進入LN皮質并與B細胞相互作用，從而促進腫瘤生長。有趣的是，與其他外泌體亞群相比，B16F10細胞的外泌體被LN高度攝取，這表明它們可能在LN轉移和與免疫系統的相互作用中起作用。在宮頸鱗狀細胞癌中，外泌體表達高水平的miR-221-3p。miR-221-3p向淋巴管內皮細胞（LEC）的轉運通過下調血管抑制因子vasohibin-1促進遷移和淋巴管生成，并促進小鼠LN轉移。MDA-MB-231 BC細胞的外泌體通過刺激巨噬細胞極化至腋窩LN中的M2腫瘤支持巨噬細胞，促進原發性腫瘤生長和淋巴轉移。在大腸癌中，外泌體IRF-2誘導前哨淋巴結巨噬細胞分泌VEGFC，導致淋巴管生成和轉移。CD97在大多數GCs中過度表達，與腫瘤細胞分化和侵襲性有關。在體外，嗜淋巴性GC細胞外泌體高表達CD97，促進細胞增殖和侵襲。在小鼠中，腳墊內注射表達CD97的外泌體可提高LN中CD55、CD44v6、CD31、EpCam、CD151和CD97的表達并增強轉移，這表明CD97通過與其他膜受體的相互作用支持PMN的形成。在肝細胞癌中，SDF-1a/CXCR4在侵襲和遷移中起重要作用。從高轉移性肝癌（Hca-F）轉移到低侵襲性肝癌（Hca-P）的CXCR4外體通過誘導MMP-9、MMP-2和VEGF-C的表達，促進Hca-P的遷移和侵襲。此外，來自Hca-F細胞的外泌體CXCR4促進了LEC的增殖和淋巴管的形成。這些研究表明，外泌體不僅在調節最終轉移部位中起關鍵作用，而且它們還調節淋巴結部位作為腫瘤細胞在其最終目的地途中的稱重站的能力。

臨床意義

外泌體引起的耐藥

耐藥性是癌癥治療的一個主要障礙。有趣的是，來源于腫瘤細胞或CAFs的外泌體可以介導化療和放療（RT）抵抗。最初，有研究表明，耐藥細胞可以在體外通過膜微粒將耐藥性轉移到藥物敏感細胞。隨后，研究表明，外泌體蛋白和小rna，包括長非編碼rna（lncRs）和miRs，影響了耐藥性，為這一現象提供了機制性的見解。在OvC細胞中，紫杉醇誘導miR-443表達，當通過外泌體轉移時，miR-443在鄰近細胞中誘導衰老，導致耐藥性。同樣，CAFs和腫瘤相關脂肪細胞分泌miR-21外泌體，可被OvC細胞吸收。MiR-21降低了APAF1的表達，導致化療耐藥和OvC細胞凋亡減少。M2極化巨噬細胞源性外泌體降低了對順鉑的敏感性，這些外泌體中的miR-21抑制了GC腫瘤細胞的凋亡并增強了PI3K/AKT信號轉導。PaC的CAF外泌有助于治療抗性；用吉西他濱治療CAFs增加了富含蝸牛和miR-146a的外泌體的分泌。這些因素共同促進了CAF和腫瘤細胞的存活。在腎細胞癌中，lncARSR被包裝入外泌體，從而轉移對敏感細胞的耐藥性。三苯氧胺耐藥的BC細胞及其外泌體中lncR-UCA1表達增加。當用富含lncUCA1的外泌體處理三苯氧胺敏感細胞時，它們產生了三苯氧胺抵抗并顯示出凋亡減少。間充質干細胞來源的外泌體被轉移到骨髓瘤細胞并通過外泌體lncPSMA3-AS1賦予蛋白酶體抑制劑耐藥性。

外泌體也可以通過誘導腫瘤干細胞增殖介導耐藥。基質外泌體轉移50個三磷酸RNA激活BC細胞的抗病毒RIG-I依賴性反應。這種激活誘導了腫瘤干細胞的擴張，從而介導了基底細胞樣基底細胞對化療和放療的臨床抵抗。CAF小泡介導miR-221轉移到BC細胞，導致CSCs擴張并導致激素治療抵抗。最后，外泌體介導的耐藥與它們的RNA含量無關。骨髓瘤細胞暴露于常用抗骨髓瘤藥物后，外泌體分泌增強。這些外泌體富含乙酰肝素酶，重組細胞外基質，改變腫瘤和宿主細胞的行為，導致化療耐藥。

治療應用

外顯體由于其天然、無毒、可生物降解的特性以及能夠跨越包括BBB在內的各種生物屏障而成為一種很有前途的藥物載體。最早證明外泌體具有這種潛在能力的工作之一，是通過在外泌體表面表達lamp2rvg，將外泌體設計成靶向中樞神經系統（CNS）的工作。這些外泌體含有siRNA，在全身給藥后產生中樞神經系統靶基因的特異性耗竭。視網膜也是一個強大的生物屏障，與傳統的AAV相比，包裹在外泌體（AAV2）內的腺病毒顯示出更強的視網膜轉導能力。在癌癥模型中，PaC患者的外泌體被設計成增強了被受體細胞吸收的能力，同時也攜帶了靶向致癌KRAS的siRNA治療藥物。當用這些外泌體治療PaC腫瘤小鼠時，原發腫瘤生長降低，證明了這種創新方法的有效性。近年來，利用促炎性免疫細胞的非修飾外泌體作為腫瘤治療手段進行了探索。M1極化的抗腫瘤巨噬細胞產生的外泌體具有向LN的趨向性，被局部巨噬細胞和dc攝取。胞外體誘導了促炎細胞因子的釋放，導致腫瘤生長抑制，并被證明是一種比CpG更有效的免疫增強劑，CpG是一種含有CpG基序以模擬病毒或細菌感染的DNA的免疫刺激合成DNA寡核苷酸，因此，它是免疫反應的強大刺激物。同樣，NK源性外泌體在體外治療后誘導B16F10細胞凋亡，并在體內抑制腫瘤生長。盡管在利用外泌體進行藥物輸送方面的這些進展有望改善治療，但仍然存在挑戰。有必要確定和優化外泌體的可交付物，以促進原發腫瘤和轉移部位的最大吸收。

外泌體作為一種治療癌癥和其他疾病的工具越來越受到人們的關注，這導致了外泌體類粒子的發展，這些粒子通常是完全合成的，因此適合用于制藥目的。此外，納米顆粒的特異性可以被改變。例如，通過將蛋白質引入囊泡表面來實現特異性，并通過結合配體進一步提高特異性。納米顆粒也易受電穿孔siRNA負載的影響，以誘導特定的擊倒。最后，外泌體樣顆粒被證明是靶向轉移部位；聚乙二醇脂質體納米粒積聚在肺轉移灶內，大小小于1毫米。這種開創性的方法可能將外泌體的治療潛力與藥物的實用性結合起來。

體液活檢外泌體的意義

由于外泌體代表其來源細胞，包含生物分子形式的信息，并分泌到血液中，因此它們是非侵入性液體活檢和早期檢測的理想候選體。因此，最近的工作一直在尋找合適的生物標志物或每種疾病的生物標志物組合。在黑色素瘤患者中，免疫檢查點蛋白PD-1和CD28在來源于T細胞和樹突狀細胞的外泌體中的表達增加被發現可以預測治療效果的改善。另外的研究表明miRs可以作為不同疾病類型的生物標志物。在急性髓系白血病中，復發仍然是一個關鍵問題，通常是治療后微小殘留病（MRD）的結果。然而，早期發現MRD可顯著防止復發。外泌體miR-150、-155和-1246的聯合表達在患者和健康個體之間存在顯著差異，這表明這些標記物可用于MRD的早期檢測。外泌體miR210和miR-1233的表達水平能夠區分透明細胞腎癌患者和健康供體。血清外泌體miR-19b3p和miR-106a的增加可以預測GC并將患者與健康獻血者區分開來，miR-7641預測了大腸癌。外體miR-223-3p在健康獻血者血漿外泌體中表達較低，但其表達隨著BC疾病的進展而增加。最后，在PaC中，外泌體miR-4525、miR-451a和miR-21的高表達與復發和預后差有關。有趣的是，DNA也可以作為一種預后工具；在PaC患者中，大量外泌體DNA數量和特異性外泌體DNA突變的頻率被證明可以預測疾病的預后。

外泌體作為一種可靠的液體活檢工具的主要障礙是建立一種最佳的分離方法。超離心（UC）是最經典也是最常用的外泌體分離方法。雖然UC在組織培養中具有健壯性和可重復性，但生物流體是凌亂的，而且很難獲得一種干凈的外泌體制劑。此外，加州大學將所有的外泌體子群體聚集在一起。非對稱流場分餾（AF4）是一種很有前途的工具，可以克服后者，并提供快速和可重復的結果，但它需要在操作儀器和分析其生成的數據和大量起始材料方面的專業知識。其他外泌體分離方法包括微流控裝置（MDs）、蔗糖梯度法（SGs）、大小排阻色譜法（SEC）和基于親和性的外體分離試劑盒（AfBs）。盡管所有這些方法都有優點，但它們缺乏穩健性（MDs、SGs和SEC）或特異性（AfBs）。因此，尋找一種穩健性強、重復性好、特異性強、可廣泛應用于臨床的方法，對于外泌體作為診斷工具的主導地位至關重要。

展望

本文所討論的工作強調了外泌體是多發性癌癥中中性粒細胞發生和轉移的關鍵決定因素（圖1）；然而，仍有一些懸而未決的問題。今后，有必要全面了解外泌體生物學，特別是關于不同蛋白質、RNA和DNA包裝的機制，以及在癌細胞中哪些特定的外泌體生物發生途徑是活躍的。因為癌細胞外泌體含有獨特的物質，因此，破譯這些過程以及它們對癌細胞的選擇性，可能會發現腫瘤特異性的治療靶向途徑。有趣的是，最近的研究發現了大量抑制ESCRT依賴性和非依賴性外泌體分泌的化合物，這表明這些藥物應進一步測試其預防體內腫瘤轉移的能力。此外，抑制Rab22a被證明可以減少外泌體分泌并損害BC細胞的轉移表型，這表明與Rab27a類似，靶向Rab22a也可以防止體內PMN的形成和轉移。最后，進一步研究不同外泌子群體與其細胞起源之間的關系可能會發現更多的治療機會。

目前還不完全了解外泌體是如何對PMN中的受體細胞重新編程的，以及在沒有外泌體的情況下PMN的持久性。到目前為止的研究表明，蛋白質和mir的持續外泌體轉移對于維持PMN可能是必要的，但是是否由于表觀遺傳或遺傳變化而導致更穩定的修飾也可能發生的研究較少。有趣的是，最近的研究表明，藥物阻斷外泌體攝取足以逆轉PMN并抑制黑色素瘤的轉移，這表明表型可塑性是可用于治療的PMN的一個特征。然而，由于外泌體介導的PMN形成機制的多樣性，PMN在其他癌癥模型中的可重復性較低，因此這些發現應該在其他情況下得到驗證。然而，正如這里所詳述的，我們目前的知識突出了一系列外泌體依賴性途徑，這些途徑已經成熟，可以作為治療靶向治療轉移。除了直接靶向外泌體進行治療外，外泌體靶向治療還應考慮其增強現有治療（如免疫治療）效力的潛在能力。

關于外泌體在調節已確定的轉移中的作用，還有許多尚未回答的問題。（1） 原發腫瘤是否繼續支持已建立的MN？（2） MN源性外泌體與原發性腫瘤外泌體有區別嗎？（3）MN的外泌體是否會在其周圍環境中引起進一步的變化，或者在其他遠處器官中培養出中性粒細胞？（4）MN外泌體是否回到原發腫瘤？研究這些區域將提高我們對外泌體依賴性轉移的理解，以便更好地利用外泌體作為轉移疾病的生物標志物和治療靶點。