TCGA 數據分析實戰 —— GSVA、ssGSEA 和單基因富集分析

前言

前面,我們介紹過了差異基因的功能富集分析,今天,我們對這部分的內容作一些補充

主要介紹一下 GEVAssGSEA 和單基因的富集分析

GSVA

我們知道,GSEA 富集分析方法是針對兩組樣本來進行評估的,也就是說對基因列表的排列方式是根據基因與表型的相關度(例如,FC 值)來計算的,無法對單個樣本使用

其富集分數(Enrichment ScoreES)的計算方式為

依次判斷基因列表中的基因是否在基因集合中,如果在基因集合中,則 ES 加上該基因與表型的相關度,如果不是集合中的基因,則減去對應的值,最后可以計算出一個最大 ES

Gene Set Variation AnalysisGSVA)與 GSEA 的原理類似,只是計算每個基因集合在每個樣本中的 enrichment statisticES,或 GSVA score),其算法流程如下

不同于 GSEA 之處在于,對于不同的數據類型(只支持 log 表達值或原始的 read counts 值),假設了不同的累積密度函數(cumulative density functionCDF

  1. 芯片數據:正態分布密度函數
  2. RNA-seq 數據:泊松分布密度函數

而且,GSVA 是為每個樣本的每個基因計算對應的 CDF 值,然后根據該值對基因進行排序,這樣,每個樣本都有一個從大到小排序的基因列表

對于某一基因集合,計算其在每個樣本中的 ES 值,也就是評估基因集合在基因列表中的富集情況。

例如,我們有一個排序后的樣本


基因集合包含:BEH,我們可以繪制這樣一張 K-S 分布圖

x 軸為排序后的基因順序,依照這一順序,如果基因在集合內,則累積和會加上該基因的值(與基因的順序有關,排名越靠前值越大),否則累積和不變。

將基因列表分為基因集內核基因集外兩個集合,就可以繪制兩個分布(紅色和綠色曲線),分別計算兩個分布之間的最大間距,以基因集內的分布值更大視為正間距(即紅色曲線更高),兩個最大間距之和即為該基因集的 ES

這樣,就把基因水平的表達矩陣轉換成了基因集水平的評分矩陣,可以使用差異表達基因識別算法,尋找顯著差異的基因集,從而達到類似功能富集的作用

1. GSVA 分析

先獲取基因表達矩陣,我們使用 TCGA 肺腺癌和肺鱗癌各 10 個樣本的 read counts 數據

library(TCGAbiolinks)

# 獲取表達矩陣
get_count <- function(cancer, n = 10) {
  query <- GDCquery(
    project = cancer,
    data.category = "Gene expression",
    data.type = "Gene expression quantification",
    platform = "Illumina HiSeq",
    file.type  = "results",
    sample.type = c("Primary Tumor"),
    legacy = TRUE
  )
  # 選擇 n 個樣本
  query$results[[1]] <-  query$results[[1]][1:n,]
  GDCdownload(query)
  # 獲取 read count
  exp.count <- GDCprepare(
    query,
    summarizedExperiment = TRUE,
  )
  return(exp.count)
}

luad.count <- get_count("TCGA-LUAD")
lusc.count <- get_count("TCGA-LUSC")

dataPrep_luad <- TCGAanalyze_Preprocessing(
  object = luad.count,
  cor.cut = 0.6,
  datatype = "raw_count"
)

dataPrep_lusc <- TCGAanalyze_Preprocessing(
  object = lusc.count,
  cor.cut = 0.6,
  datatype = "raw_count"
)
# 合并數據并使用 gcContent 方法進行標準化
dataNorm <- TCGAanalyze_Normalization(
  tabDF = cbind(dataPrep_luad, dataPrep_lusc),
  geneInfo = TCGAbiolinks::geneInfo,
  method = "gcContent"
)
# 分位數過濾
dataFilt <- TCGAanalyze_Filtering(
  tabDF = dataNorm,
  method = "quantile",
  qnt.cut =  0.25
)

# 將數據拆分
luad.exp <- subset(dataFilt, select = luad.count$barcode)
lusc.exp <- subset(dataFilt, select = lusc.count$barcode)

我們使用 GSVA 包提供的 gsva 函數來將基因表達矩陣轉換為基因集分數矩陣

library(GSVA)
library(GSEABase)

# 讀取從 GSEA 官網下載的通路數據
c2gmt <- getGmt("~/Downloads/data/pathway/c2.cp.v7.2.symbols.gmt")
# 刪選出常用的這三個數據庫中的通路
gene.set <- c2gmt[grep("^KEGG|REACTOME|BIOCARTA", names(c2gmt)),]
# gsva 分析,read counts 使用泊松分布,通路至少包含 10 個基因
gs.exp <- gsva(dataFilt, gene.set, kcdf = "Poisson", min.sz = 10)

雖然 GSVAdata 包提供了通路數據 c2BroadSets 是基因 ID,但我們的基因表達數據的行是基因 Symbol,所以通路信息也必須是 Symbol 格式,要進行格式轉換,比較麻煩

所以我們使用 GSEABase 包提供的 getGmt 函數來讀取從 GSEA 官網下載的 C2 通路信息

得到結果如下,共包含 1511 條通路

然后,使用差異基因識別方法

2. 差異分析

我們使用 limma 分析差異通路

DEA.gs <- TCGAanalyze_DEA(
  mat1 = gs.exp[, colnames(luad.exp)],
  mat2 = gs.exp[, colnames(lusc.exp)],
  metadata = FALSE,
  pipeline = "limma",
  Cond1type = "LUAD",
  Cond2type = "LUSC",
  fdr.cut = 0.05,
  logFC.cut = 0.5,
)

通過設置 FDR = 0.05,logFC = 0.5 共篩選出 40 條差異通路

查看通路的火山圖


我們可以一起看下基因的火山圖

DEA.gene <- TCGAanalyze_DEA(
  mat1 = luad.exp,
  mat2 = lusc.exp,
  metadata = FALSE,
  pipeline = "limma",
  Cond1type = "LUAD",
  Cond2type = "LUSC",
  fdr.cut = 0.01,
  logFC.cut = 1
)

總共識別出 804 個差異表達基因

ssGSEA

single sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA) 是針對單個樣本進行 GSEA 分析,其基因列表的排序方式和 ES 的計算方式都是依賴于樣本中基因的表達值,而不再是依賴基因與表型的相關度

使用方式也很簡單,只要在 gsva 函數中指定 method = "ssgsea",例如

res.ssgsea <- gsva(dataFilt, gene.set, method = "ssgsea", kcdf = "Poisson", min.sz = 10)

也可以進行差異分析

DEA.ssgsea <- TCGAanalyze_DEA(
  mat1 = res.ssgsea[, colnames(luad.exp)],
  mat2 = res.ssgsea[, colnames(lusc.exp)],
  metadata = FALSE,
  pipeline = "limma",
  Cond1type = "LUAD",
  Cond2type = "LUSC",
  fdr.cut = 0.05,
  logFC.cut = 0.1,
)

或者繪制熱圖

annotation_col <- data.frame(sample = rep(1:2, each = 10))
rownames(annotation_col) <- colnames(res.ssgsea)
pheatmap(
  res.ssgsea[rownames(DEA.ssgsea),],
  show_colnames = F,
  # 不展示行名
  cluster_rows = F,
  # 不對行聚類
  cluster_cols = F,
  # 不對列聚類
  annotation_col = annotation_col,
  # 加注釋
  cellwidth = 5,
  cellheight = 5,
  # 設置單元格的寬度和高度
  fontsize = 5
)

單基因富集分析

單基因富集分析并不是說拿單個基因來進行富集分析,單個基因怎么能進行富集分析呢?一個基因根本沒法進行統計檢驗。

其實,這里說的單基因并不是拿單個基因來富集,而是基于單個基因來進行富集分析,這個“基于”,就是以單個基因為基礎,向外擴展,抓取與其相關的基因,然后用這些相關的基因來進行功能富集

所以,要理解這個單基因富集分析的意思,這樣一說就已經很明了了。針對單個基因我們可以做什么?

主要有兩種做法:

  1. 定性分組:我們可以根據給定基因的表達值對樣本進行分組,然后識別在兩組樣本之間差異表達的基因,最后用這些差異表達基因來進行功能富集

  2. 定量相關:通過計算其他基因與目標基因表達之間的相關性,將具有顯著相關的基因作為一個集合,也可以進行富集分析

1. 定性分組

我們以 CCDC134 基因為例,以該基因表達值的中位值來對樣本進行分組

gene <- "CCDC134"
gene.exp <- dataFilt[gene,]

label <- if_else(gene.exp < median(gene.exp), 0, 1)

group.low <- dataFilt[,label == 0]
group.high <- dataFilt[,label == 1]

識別兩組樣本之間的差異表達基因

DEGs <- TCGAanalyze_DEA(
  mat1 = group.low,
  mat2 = group.high,
  metadata = FALSE,
  pipeline = "limma",
  Cond1type = "CCDC134_Low",
  Cond2type = "CCDC134_High",
  fdr.cut = 0.01,
  logFC.cut = 1,
)

共識別出 873 個差異表達基因

2. 定量相關

我們對其他基因與 CCDC134 基因進行相關性檢驗,由于基因較多,我們使用并行的方式來計算

library(future.apply)

batch_cor <- function(exp, gene){
  y = as.numeric(exp[gene,])
  gene_list = rownames(exp)
  gene_list = gene_list[rownames(exp) != gene]
  do.call(rbind, future_lapply(gene_list, function(x){
    ct  <- cor.test(as.numeric(exp[x,]), y, type='spearman')
    data.frame(key = gene, gene = x, cor = ct$estimate,p.value = ct$p.value )
  }))
}

plan(multiprocess)
system.time(res.cor <- batch_cor(dataFilt, gene))

對結果進行過濾,篩選出顯著相關且相關系數的絕對值大于 0.6 的基因,共篩選出 232 個基因

cor.genes <- filter(res.cor, p.value < 0.05 & abs(cor) > 0.6)

3. 富集分析

格式化識別出的差異基因

library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
library(enrichplot)

gene.id <- bitr(
  rownames(DEGs), fromType = "SYMBOL",
  toType = "ENTREZID",
  OrgDb = org.Hs.eg.db
)

go <- enrichGO(
  gene = gene.id,
  OrgDb = org.Hs.eg.db,
  ont = "ALL",
  pAdjustMethod = "BH",
  qvalueCutoff = 0.05,
  readable = T
)
dotplot(go)

gene_info <- DEGs %>%
  rownames_to_column(var = "SYMBOL") %>%
  inner_join(., gene.id[,1:2], by = "SYMBOL") %>%
  # 必須降序
  arrange(desc(logFC))

# 構造輸入數據格式
geneList <- gene_info$logFC
names(geneList) <- as.character(gene_info$ENTREZID)

go2 <- gseGO(
  geneList     = geneList,
  OrgDb        = org.Hs.eg.db,
  ont          = "ALL",
  minGSSize    = 10,
  maxGSSize    = 500,
  pvalueCutoff = 0.1,
  verbose      = FALSE
)

兩種富集方法都沒有富集到 go 通路,對于相關基因也是沒有富集到通路的。選的這個基因不行

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