單細胞富集分析系列：
1. 背景
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Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)用來評估一個預先定義的基因集的基因在與表型相關度排序的基因表中的分布趨勢，從而判斷其對表型的貢獻。其輸入數據包含兩部分，一是已知功能的基因集 (可以是GO注釋、MsigDB的注釋或其它符合格式的基因集定義)，一是表達矩陣(也可以是排序好的列表)，軟件會對基因根據其于表型的關聯度(可以理解為表達值的變化)從大到小排序，然后判斷基因集內每條注釋下的基因是否富集于表型相關度排序后基因表的上部或下部，從而判斷此基因集內基因的協同變化對表型變化的影響。 -
Gene Set Variation Analysis(GSVA)被稱為基因集變異分析，是一種非參數的無監督分析方法，主要用來評估芯片和轉錄組的基因集富集結果。主要是通過將基因在不同樣品間的表達量矩陣轉化成基因集在樣品間的表達量矩陣，從而來評估不同的代謝通路在不同樣品間是否富集。GSVA和GSEA兩者的輸入數據相似，包括已知功能的基因集和表達矩陣 。 - GSEA和GSVA與GO等富集分析的不同：
一般的富集分析（GO和KEGG）僅考慮差異基因，沒有考慮基因表達量 ，這容易遺漏部分差異表達不顯著卻有重要生物學意義的基因，忽略一些基因的生物特性、基因調控網絡之間的關系及基因功能和意義等有價值的信息。一刀切的閾值，對于發現真正的生物學效應，許多時候是一種障礙。而GSEA與GSVA使用的不是差異基因集而是全部基因。從基因集的富集角度出發，理論上更容易發現細微變化對生物通路的影響，尤其是差異倍數不太大的基因集。
參考：基因功能富集方法和基因注釋數據庫介紹
2. 原理
2.1 GSEA
(1) 背景基因排序：將全部基因按照某種指標（差異分析p值，表型相關性，表達量等）進行排序，比如log2FC排序。
(2) 目標基因富集：將某個特定類型的基因在排序表中標出，目標基因可以是某個通路或GO terms的基因等。
(3) 計算富集分數：使用加權法，計算ES值變化。對位于中部（與性狀相關性低）的部分采用較小的權值，所以越集中在兩端，與表型的相關性越高。ES曲線最大值為富集分數（Enrichment Score）。
(4) Permutation test：對基因集的ES值進行顯著性檢驗及多重假設檢驗，從而計算出顯著富集的基因集。
2.2 GSVA
GSEA雖然是一種強大的富集分析工具，但是它的應用場景通常局限于Case/Control的實驗設計。對于表型（分組）復雜的大樣本量研究，比如scRNAseq和TCGA這樣的項目，分析起來就顯得困難。因此，Broad研究所又開發了GSVA算法來拓展基因集分析的應用。GSVA不需要預先進行樣本之間的差異分析，它依據表達矩陣就可以計算每個樣本中特定基因集的變異分數。
在輸入后基因表達矩陣和特定基因集以后：
(1) 算法會對表達數據進行核密度估計；
(2) 基于第一步的結果對樣本進行表達水平排序；
(3) 對于每一個基因集進行類似K-S檢驗的秩統計量計算；
(4) 獲取GSVA富集分數。最終輸出為以每個基因集對應每個樣本的數據矩陣。
簡單的說，輸入以基因為行的表達矩陣和基因集數據庫給GSVA，它就輸出以基因集名稱為行的變異分數矩陣。
左側輸入基因表達矩陣和基因集數據庫，中間是GSVA算法原理，右側是輸出的基因集變異分數矩陣。基因集變異分數可以理解為基因集內所有基因的綜合表達值。
2.3 總結：
GSEA和GSVA都是基于對基因的某一個值的排序來進行富集分析。
GSEA主要是用case和control之間的差異倍數或信噪比來進行排序（一次處理兩個樣本）。GSVA則不需要做對比，而是對每個樣本或單個細胞按基因的表達量進行單獨排序，然后將富集分數的值做個標準化，再在不同的樣本間對比。
3. 分析
library(Seurat)
library(msigdbr)
library(GSVA)
library(tidyverse)
library(clusterProfiler)
library(patchwork)
rm(list=ls())
setwd("Function")
dir.create("GSEA")
dir.create("GSVA")
3.1 GSEA
- 讀入注釋好的數據，進行差異分析，得到差異表達矩陣
scRNA <- readRDS("scRNA.classified.rds")
# 樣本分組
scRNA$group <- recode(scRNA$orig.ident,
"HNC01PBMC" = "hnc_pbmc",
"HNC01TIL" = "hnc_til",
"HNC10PBMC" = "hnc_pbmc",
"HNC10TIL" = "hnc_til",
"HNC20PBMC" = "hnc_pbmc",
"HNC20TIL" = "hnc_til",
"PBMC1" = "PBMC",
"PBMC2" = "PBMC",
"Tonsil1" = "Tonsil",
"Tonsil2" = "Tonsil")
scRNA$celltype <- scRNA$SingleR
# 按細胞類型將對象分割
scRNA.list <- SplitObject(scRNA, split.by = "celltype")
# 數據標準化
scRNA.list <- lapply(scRNA.list, function(sco){
DefaultAssay(sco) <- "RNA"
sco <- NormalizeData(sco)
return(sco)
})
# 檢查數據
for(i in names(scRNA.list)){
print(i)
print(table(scRNA.list[[i]][["group"]]))
}
# 剔除NKT細胞（數目太少）
scRNA.list <- scRNA.list[1:6]
# 按細胞類型配對差異分析
library(future)
options(future.globals.maxSize = 20 * 1024^3)
plan(multisession, workers = 8)
deg.list <- lapply(scRNA.list, FUN = function(x) {
FindMarkers(x, ident.1 = "hnc_til", ident.2 = "hnc_pbmc", assay = "RNA",
group.by = "group", logfc.threshold = 0, min.pct = 0)})
saveRDS(deg.list, file = "deg.list.rds")
View(deg.list)
使用FindMarkers對hnc_til和hnc_pbmc兩組的6個細胞群的18818個基因做了差異分析
- GSEA分析（KEGG數據集）
此前寫過選取單個cluster的差異基因進行GSEA分析，見：單細胞GSEA分析流程，在這里演示批量操作。
filenames = c("CD8_TCs","DCs","Monocytes", "CD4_TCs", "NKs", "BCs")
#??filenames順序一定要和deg.list中順序一致，否則最后導出文件會 出錯。
dir.create("GSEA/kegg")
setwd("./GSEA/kegg")
# 設置基因集
genesets = msigdbr(species = "Homo sapiens", category = "C2") #msigdbr提供多個物種的基因集數據
# View(msigdbr_collections()) #查看msigdbr包中所有的基因集
unique(genesets$gs_subcat) # 有多個數據庫來源的基因集可選，這里選用KEGG
genesets <- subset(genesets, gs_subcat=="CP:KEGG", select = c("gs_name", "gene_symbol"))
unique(genesets$gs_name) #查看有多少條通路（186個）
# GSEA分析
deg.list <- readRDS("deg.list.rds")
res.list <- lapply(deg.list, FUN = function(x){
x = x[order(x$avg_log2FC, decreasing = T),]
genelist <- structure(x$avg_log2FC, names = rownames(x))
res <- GSEA(genelist, TERM2GENE = genesets, eps = 0)
return(res) #按差異倍數進行排序并返回GSEA結果
})
res.list的結構。輸入進行比較的通路有186個，輸出的每個組的通路各不相同（CD8T有29個，B只有1個）。
# 導出表格
for(i in seq_along(res.list)){
res <- data.frame(res.list[[i]])
write.csv(res, paste0(filenames[i], ".csv"), row.names = F)
}
運行完上面的代碼，工作目錄下每個細胞都會有一個GSEA差異分析矩陣。矩陣的橫軸是通路，縱軸是富集分數、NES值、p值、q值以及富集到每條通路上的基因等
# 導出圖形
for(i in seq_along(res.list)){
res <- res.list[[i]]
for(j in seq_along(res@result$ID)){
p <- gseaplot(res, geneSetID = j, title = res@result$ID[j], by = "runningScore")
filename <- paste0(filenames[i], "_", res@result$ID[j], '.pdf')
ggsave(filename = filename, p, width = 8, height = 4)
}
} #每個細胞類型針對每個通路，都會出一個圖
setwd("~/project/Function")
3.2 分組平均水平GSVA
單細胞表達矩陣上有一萬多個基因，但實際上在單個細胞水平上，很多基因的表達都是0，因此在做單個細胞水平上的GSEA，排序結果會有問題。但是按分組排序的話，基本上每個基因都有一個表達量的值（非零），非零的基因會比單細胞矩陣要多得多，得出的排序結果會更準。
- 數據準備
rm(list = ls())
scRNA <- readRDS("scRNA.classified.rds")
DefaultAssay(scRNA) <- "RNA"
scRNA <- NormalizeData(scRNA)
- 基因集準備（Hallmark基因集）
setwd("Function")
dir.create("GSVA/avg_hallmark")
setwd("./Function/GSVA/avg_hallmark")
# 選擇基因集
genesets <- msigdbr(species = "Homo sapiens", category = "H")
genesets <- subset(genesets, select = c("gs_name","gene_symbol")) %>% as.data.frame()
genesets <- split(genesets$gene_symbol, genesets$gs_name)
- 提取分組平均表達矩陣
#Idents設置按什么來取組的表達均值（計算case control之間的均值也可以）
Idents(scRNA) <- "SingleR"
expr <- AverageExpression(scRNA, assays = "RNA", slot = "data")[[1]]
expr <- expr[rowSums(expr)>0,] #選取非零基因
expr <- as.matrix(expr)
- GSVA富集分析
# gsva默認開啟全部線程計算
gsva.res <- gsva(expr, genesets, method="ssgsea")
saveRDS(gsva.res, "gsva.res.rds")
gsva.df <- data.frame(Genesets=rownames(gsva.res), gsva.res, check.names = F)
write.csv(gsva.df, "gsva_res.csv", row.names = F)
gsva.df
pheatmap::pheatmap(gsva.res, show_colnames = T, scale = "row")
另：如果做KEGG基因集的變異分析，和Hallmark基因集一樣，只是在做基因集準備的時候換成下面的代碼即可。 ??注意切換路徑
genesets <- msigdbr(species = "Homo sapiens", category = "C2")
genesets <- subset(genesets, gs_subcat=="CP:KEGG", select = c("gs_name", "gene_symbol")) %>% as.data.frame()
genesets <- split(genesets$gene_symbol, genesets$gs_name)
3.3 單細胞水平GSVA
單細胞水平GSVA，在細胞數比較多（比如說幾萬個細胞）的情況下，再選用pathway比較多的數據集比如KEGG，運行會很慢，可能需要數小時到1-2天。
- 數據準備
rm(list = ls())
scRNA <- readRDS("scRNA.classified.rds")
DefaultAssay(scRNA) <- "RNA"
scRNA <- NormalizeData(scRNA)
- 基因集準備（KEGG基因集）
setwd("Function")
dir.create("GSVA/kegg")
setwd("./GSVA/kegg")
# 選擇基因集
genesets <- msigdbr(species = "Homo sapiens", category = "C2")
genesets <- subset(genesets, gs_subcat=="CP:KEGG", select = c("gs_name", "gene_symbol")) %>% as.data.frame()
genesets <- split(genesets$gene_symbol, genesets$gs_name)
- 提取單細胞表達矩陣
expr <- as.matrix(scRNA@assays$RNA@data)
#set.seed(seed = 123)
#expr <- expr[,sample(colnames(expr), 1000)]
expr <- expr[rowSums(expr)>0,] #選取非零基因
- GSVA富集分析
# gsva默認開啟全部線程計算
gsva.res <- gsva(expr, genesets, method="ssgsea", parallel.sz=8)
saveRDS(gsva.res, "gsva.res.rds")
gsva.df <- data.frame(Genesets=rownames(gsva.res), gsva.res, check.names = F)
write.csv(gsva.df, "gsva_res.csv", row.names = F)
- 指定基因集展示
??注意基因集的名字中把“_”改為“-”，不然會顯示找不到pathway
scRNA[["gsva"]] <- CreateAssayObject(gsva.res)
DefaultAssay(scRNA) <- "gsva"
VlnPlot(scRNA, features = "KEGG-ABC-TRANSPORTERS",
group.by = "SingleR", slot = "counts", pt.size = 0)
pheatmap::pheatmap(gsva.res, show_colnames = F, scale = "row")
