前言
通常，在識(shí)別完了差異基因之后，都會(huì)對(duì)差異基因進(jìn)行功能富集，來獲取差異基因參與的潛在生物學(xué)功能通路或生物學(xué)進(jìn)程，有助于理解基因之間的作用關(guān)系以及發(fā)現(xiàn)基因在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用。
通路，通常是一些已知的功能相關(guān)的基因集合，而我們常說的基因集合，一般是忽略了基因之間互作關(guān)系的通路。
最常見的通路富集，是使用 GO 和 KEGG 數(shù)據(jù)庫中預(yù)定義的生物學(xué)通路。
1. Gene Ontology (GO)
Gene Ontology（基因本體）定義了用于描述基因功能的類，以及這些類之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系，主要可以分為三類：
-
Molecular Function(MF)：分子功能，基因產(chǎn)物的生物學(xué)活性，如催化或結(jié)合等 -
Cellular Component(CC)：細(xì)胞組分，即基因產(chǎn)物發(fā)揮作用的地方，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等 -
Biological Process(BP)：由分子功能組成的一系列反應(yīng)過程。
2. KEGG
KEGG 是系統(tǒng)分析基因功能和基因組信息的數(shù)據(jù)框，是一個(gè)整合了基因組、生物學(xué)通路、疾病、藥物以及生物化學(xué)物質(zhì)等信息的數(shù)據(jù)庫。
KEGG 通路由一系列經(jīng)手工繪制而成的通路圖構(gòu)成，每張通路圖均包含分子之間相互作用和反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，旨在將基因組中的基因與基因產(chǎn)物（主要是蛋白質(zhì)）聯(lián)系起來，記錄了細(xì)胞中分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及具體生物所特有的變化形式。
這些通路主要分為 7 大類：
- 新陳代謝（
Metabolism） - 遺傳信息處理（
Genetic Information Processing） - 環(huán)境信息處理（
Environmental Information Processing） - 細(xì)胞過程（
Cellular Processes） - 生物系統(tǒng)（
Organismal Systems） - 人類疾病（
Human Diseases） - 藥物開發(fā)（
Drug development）
3. 其他數(shù)據(jù)庫
當(dāng)然，除了我們最常用的 GO 和 KEGG，還有一些其他數(shù)據(jù)庫定義的基因集，例如：
-
Molecular Signatures Database(MSigDb) Reactome-
Disease Ontology(DO) -
Disease Gene Network(DisGeNET)
富集分析方法
富集分析方法主要可以分為四類：
- 過表達(dá)分析：通常是檢驗(yàn)差異基因是否顯著集中在預(yù)先定義的基因集
- 累積超幾何或
Fisher精確檢驗(yàn)
式中，N 為背景基因的數(shù)量，M 為通路中的基因數(shù)，n 為興趣基因的數(shù)量，k 為通路中興趣基因的數(shù)量
- 顯著性打分：對(duì)所有差異基因進(jìn)行打分或排序，并評(píng)估基因集中的基因的富集分?jǐn)?shù)
-
GSEA
對(duì)于一個(gè)給定的已排序的差異基因列表L，以及預(yù)定義的基因集S。GSEA算法的原理是，通過判斷S中的基因s是隨機(jī)分布還是主要集中在L的頂部或底部，來衡量該基因集合S對(duì)表型差異的貢獻(xiàn) -
ssGSEA
單樣本GSEA分析 GSVA
- 基于通路拓?fù)洌荷鲜鰞煞N方法將通路中的基因視為獨(dú)立的，但是通路中基因之間具有緊密的互作關(guān)系，將這些信息考慮到富集分析中，比如，上游基因的改變對(duì)通路功能的影響比下游基因更大，所以，可以將基因的連接度以及調(diào)控類型信息以權(quán)重的方式加入富集分析當(dāng)中。
Pathway-ExpressNetGSAtopologyGSADEGraph-
PathNet等
- 基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洌憾诰W(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞母患椒ǎ瑒t是把基因在網(wǎng)絡(luò)中的互作關(guān)系整合到富集分析當(dāng)中
EnrichNetNEANOA
分析示例
我們使用上一節(jié)三種方法共同識(shí)別出的 2749 個(gè)差異基因
> load("~/Downloads/gbm_lgg_deg.rda")
> gene_list <- rownames(DEGs.exp)
> DEGs.exp[1:6, 1:3]
TCGA-HT-A614-01A-11R-A29R-07 TCGA-HT-8104-01A-11R-2404-07 TCGA-TQ-A7RG-01A-11R-A33Z-07
A1BG 225 238 148
A2BP1 610 471 181
A2LD1 117 190 38
AATK 9071 3330 2785
ABAT 16024 17488 40945
ABCC3 11 192 9
1. GO
使用 TCGABiolinks 提供的 TCGAanalyze_EAcomplete 函數(shù)來進(jìn)行 go 富集
system.time(
ansEA <- TCGAanalyze_EAcomplete(
TFname="gbm Vs lgg", gene_list
)
)
TCGAvisualize_EAbarplot(
tf = rownames(ansEA$ResBP),
GOBPTab = ansEA$ResBP,
GOCCTab = ansEA$ResCC,
GOMFTab = ansEA$ResMF,
PathTab = ansEA$ResPat,
nRGTab = gene_list,
nBar = 10,
filename = "~/Downloads/go_enrichment.pdf"
)
或者使用 clusterProfiler 包進(jìn)行富集分析，該包提供了兩個(gè)函數(shù)
-
enrichGO：過表達(dá)富集分析方法 -
gseGO：GSEA富集分析方法
1.1 enrichGO
該函數(shù)需要輸入 entrez_gene_id，所以要先對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)換
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
library(enrichplot)
# symbol to ID
gene.id <- bitr(
gene_list, fromType = "SYMBOL",
toType = "ENTREZID",
OrgDb = org.Hs.eg.db
)
> head(gene.id)
SYMBOL ENTREZID
1 A1BG 1
4 AATK 9625
5 ABAT 18
6 ABCC3 8714
7 ABCC8 6833
8 ABCG4 64137
進(jìn)行富集分析
go <- enrichGO(
gene = gene.id,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
ont = "ALL",
pAdjustMethod = "BH",
qvalueCutoff = 0.05,
readable = T
)
> head(go)
ONTOLOGY ID Description GeneRatio BgRatio pvalue
GO:0050804 BP GO:0050804 modulation of chemical synaptic transmission 150/2256 454/18866 4.314421e-33
GO:0099177 BP GO:0099177 regulation of trans-synaptic signaling 150/2256 455/18866 5.706736e-33
GO:0050808 BP GO:0050808 synapse organization 136/2256 433/18866 1.356042e-27
GO:0042391 BP GO:0042391 regulation of membrane potential 134/2256 443/18866 1.907415e-25
GO:0050890 BP GO:0050890 cognition 97/2256 302/18866 8.988934e-21
GO:0099003 BP GO:0099003 vesicle-mediated transport in synapse 79/2256 220/18866 1.893468e-20
p.adjust qvalue
GO:0050804 1.716872e-29 1.281913e-29
GO:0099177 1.716872e-29 1.281913e-29
GO:0050808 2.719769e-24 2.030733e-24
GO:0042391 2.869229e-22 2.142329e-22
GO:0050890 1.081728e-17 8.076794e-18
GO:0099003 1.898833e-17 1.417776e-17
繪制富集分析結(jié)果的通路點(diǎn)圖，點(diǎn)的大小表示通路中的基因數(shù)量，顏色表示的是顯著性
dotplot(go)
條形圖
barplot(go)
1.2 gseGO
GSEA 富集分析輸入的基因列表需要排序，我們可以按照基因的 logFC 值對(duì)基因進(jìn)行排序
gene_info <- DEGs.edgeR %>%
rownames_to_column(var = "SYMBOL") %>%
filter(SYMBOL %in% gene_list) %>%
inner_join(., gene.id[,1:2], by = "SYMBOL") %>%
# 必須降序
arrange(desc(logFC))
# 構(gòu)造輸入數(shù)據(jù)格式
geneList <- gene_info$logFC
names(geneList) <- as.character(gene_info$ENTREZID)
GSEA 富集分析
go2 <- gseGO(
geneList = geneList,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
ont = "ALL",
minGSSize = 100,
maxGSSize = 500,
pvalueCutoff = 0.05,
verbose = FALSE
)
> head(go2)
ONTOLOGY ID Description setSize enrichmentScore NES pvalue p.adjust
GO:0000228 CC GO:0000228 nuclear chromosome 188 -0.3746191 -3.036128 1e-10 5.903226e-10
GO:0000278 BP GO:0000278 mitotic cell cycle 198 -0.4102983 -3.349095 1e-10 5.903226e-10
GO:0001501 BP GO:0001501 skeletal system development 115 -0.4414610 -3.234870 1e-10 5.903226e-10
GO:0001525 BP GO:0001525 angiogenesis 117 -0.4349952 -3.197417 1e-10 5.903226e-10
GO:0001568 BP GO:0001568 blood vessel development 158 -0.4020008 -3.119252 1e-10 5.903226e-10
GO:0001775 BP GO:0001775 cell activation 263 -0.3259590 -2.814883 1e-10 5.903226e-10
qvalues rank leading_edge
GO:0000228 2.286361e-10 672 tags=53%, list=27%, signal=41%
GO:0000278 2.286361e-10 930 tags=70%, list=38%, signal=47%
GO:0001501 2.286361e-10 294 tags=36%, list=12%, signal=33%
GO:0001525 2.286361e-10 847 tags=67%, list=35%, signal=46%
GO:0001568 2.286361e-10 571 tags=48%, list=23%, signal=39%
GO:0001775 2.286361e-10 1220 tags=79%, list=50%, signal=44%
繪制第一條 GO item 的富集曲線
gseaplot(go2, geneSetID = "GO:0000228")
曲線表示富集分?jǐn)?shù)的計(jì)算過程，根據(jù)基因排序，從左至右依次計(jì)算。從圖中可以看出富集分?jǐn)?shù)都是小于 0，表示基因富集在通路的下部。中間的豎線表示通路中的基因在列表中的位置
繪制第二種類型的富集曲線，添加了中間的基因與表型之間的相關(guān)矩陣熱圖，紅色表示與第一個(gè)表型正相關(guān)，藍(lán)色表示與第二個(gè)表型正相關(guān)
gseaplot2(go2, 1)
可以同時(shí)顯示第 1-3 個(gè)富集分析結(jié)果的富集曲線
gseaplot2(go2, 1:3)
2. KEGG
KEGG 通路富集也有兩種方法
enrichKEGGgseKEGG
2.1 enrichKEGG
kegg <- enrichKEGG(
gene = gene.id$ENTREZID,
organism = "hsa",
pvalueCutoff = 0.05
)
> head(kegg)
ID Description GeneRatio BgRatio pvalue p.adjust
hsa05033 hsa05033 Nicotine addiction 24/1087 40/8108 6.620414e-12 2.138394e-09
hsa04724 hsa04724 Glutamatergic synapse 43/1087 114/8108 4.747252e-11 7.666812e-09
hsa04727 hsa04727 GABAergic synapse 36/1087 89/8108 1.824548e-10 1.964430e-08
hsa04911 hsa04911 Insulin secretion 32/1087 86/8108 2.129231e-08 1.719354e-06
hsa04080 hsa04080 Neuroactive ligand-receptor interaction 81/1087 341/8108 8.656665e-08 4.646393e-06
hsa04721 hsa04721 Synaptic vesicle cycle 29/1087 78/8108 9.964211e-08 4.646393e-06
qvalue
hsa05033 1.561024e-09
hsa04724 5.596760e-09
hsa04727 1.434031e-08
hsa04911 1.255125e-06
hsa04080 3.391859e-06
hsa04721 3.391859e-06
dotplot(kegg)
2.2 gseKEGG
kegg2 <- gseKEGG(
geneList = geneList,
organism = 'hsa',
minGSSize = 120,
pvalueCutoff = 0.05,
verbose = FALSE
)
gseaplot(kegg2, geneSetID = "hsa05033")
gseaplot2(kegg2, geneSetID = "hsa05033")
3 結(jié)果可視化
3.1 通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)
通過展示通路中基因之間的互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以看出基因在網(wǎng)絡(luò)中的作用關(guān)系，以及潛在的生物學(xué)功能
ego <- setReadable(kegg, 'org.Hs.eg.db', 'ENTREZID')
p1 <- cnetplot(ego, showCategory = 2, foldChange = geneList)
# 設(shè)置分類的大小，可以是 pvalue 或 geneNum
p2 <-
cnetplot(
ego,
showCategory = 2,
categorySize = "geneNum",
foldChange = geneList
)
# 設(shè)置圓形布局
p3 <-
cnetplot(
ego,
showCategory = 3,
foldChange = geneList,
circular = TRUE,
colorEdge = TRUE
)
# 合并圖形
cowplot::plot_grid(
p1, p2, p3, ncol = 3,
labels = LETTERS[1:3],
rel_widths = c(.8, .8, 1.2)
)
3.2 熱圖
使用熱圖的方式展示通路中基因的表達(dá)模式
heatplot(ego, foldChange=geneList)
3.3 Enrichment Map
Enrichment Map 是根據(jù)通路之間是否有基因交疊來確定通路間是否存在互作邊
edo <- pairwise_termsim(kegg)
emapplot(edo, layout="kk")
對(duì)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類展示
emapplot_cluster(edo, node_scale=1.5, layout="kk")
3.4 UpSet plot
使用 upsetplot 函數(shù)來繪制通路的 upset 圖
upsetplot(edo)
也可以繪制 GSEA 分析的結(jié)果
upsetplot(go2)
3.5 山脊圖
ridgeplot 函數(shù)可以繪制 GSEA 分析結(jié)果，可以很容易地看出上調(diào)和下調(diào)的通路
ridgeplot(go2)
先介紹這些吧，相關(guān)的內(nèi)容如 GSVA、ssGSEA、單基因富集分析等后續(xù)再做介紹
