一、何為 SSR ?
SSR ( simple sequence repeats ) 即簡單重復序列，也稱為微衛星 DNA(microsatellite DNA )，在真核生物基因組中廣泛存在，一般是以1-bp 組成較低程度的重復序列，主要以2-3個核酸為重復單位如(GA)n、(AC)n 和(GAA)n 等。
從進化角度看物種間重復序列的差異是自然選擇的結果。因此鑒定SSR在基因組分析中有重要意義。微衛星在原核生物和真核生物基因組中隨機分布，而且該標記呈共顯性，符合孟德爾遺傳模式，易于操作，具有高度重復性和可靠性，顯示出較強的多態性等優點，使其在遺傳連鎖圖譜構建、遺傳多樣性檢測、基因定位及分子標記輔助選擇等領域有重要應用
SSR 通常可以分為基因組 SSR 和 EST-SSR 兩大類。GenomicSSR 是基于基因組序列開發的，開發起來費時費力，而且因為探針的緣故，種類比較局限，EST-SSR是指存在于表達的基因序列內的SSR，不包括存在于內含子及非表達的調控區等之中的SSR，通常三個堿基重復的占多數，與不引起基因翻譯過程中移碼現象的發生相一致，EST-SSR有更強的種屬轉移性。不過一般EST-SSR的重復序列要短于基因組中的SSR，而且從EST中篩選的微衛星要比從基因組中篩選的微衛星多態性低。
二、使用 Misa 結合 Primer3 來批量設計 SSR 引物
MISA，英文全稱為Micro Satellite identification tool，即微衛星識別工具。
MISA是使用 perl 編寫的一支程序，能識別出序列中的微衛星和復合微衛星（兩個微衛星之間由由不多于100bp的堿基對隔開），并給出其所在位點。
MISA下載網址：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html
1. MISA 用法：
misa.pl filename
其中，fastfile是序列文件，同時在運行程序的工作目錄下必須有一個名稱為“misa.ini”
的文件。該文件內容為：
definition(unit_size,min_repeats): 1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
interruptions(max_difference_for_2_SSRs): 100
該文件指定了misa的參數，即1個堿基重復10次及10次以上；2個堿基重復6次及6 次以上；
3個堿基重復5次及5次以上；4個堿基重復5次及5次以上；5個堿基重復5 次及5次以上；6堿
基重復5次及5次以上，這樣的堿基重復序列才算是微衛星序列。 同時，兩個微衛星之間的距離小于100bp的時候，兩個微衛星組成一個復合微衛星。
MISA的輸出結果：
MISA會在 fastafile 所在的文件夾下生成兩個文件，分別是 “.misa” 和 “.statistics”
-
.misa：以表格的形式列出微衛星的類型和位點； -
.statistics：統計微衛星的類型和頻數。
在MISA的下載頁面中，提供了3個附加的 perl 腳本，分別是：Get_est_trimmer.pl，p3_in.pl 和 p3_out.pl。
由于 MISA 程序讀取 fasta 文件中的序列 ID，將序列 ID 中的空格用下劃線 ”_” 填補了，所以在fasta文件中，其序列ID最好不要有空格。否則運行接下來的程序時，會出問題。
Get_est_trimmer.pl
針對EST序列，可以除去EST序列中短的序列和兩端不明確的堿基。
2.第二步：
p3_in.pl 輸入 misa.pl 的輸出結果，將引物設計的參數文件（模板，產物長度，目標區域等）導入到一個以“p3in”為后綴的文件中。
p3_in.pl filename.misa
3.第三步：
primer3主設計引物腳本
primer3_core -default_version=1 -output=filename.p3out filename.p3in
4.第四步：
p3_out.pl對primer3產生的文件進行提取合，得到最后的結果文件 filename.result
p3_out.pl filename.p3out filename.misa
tips： p3_in.pl 和 p3_out.pl 這兩個程序可能需要修改才能正常使用。
參考：http://www.chenlianfu.com/?p=255
(19條消息) 使用Misa結合Primer3來批量設計SSR引物_misa安裝_awk_bioinfo的博客-CSDN博客
