先下載 primer3 和 misa 相關(guān)文件

# 下載 primer3
conda search primer3 
conda install -y primer3
# misa 相關(guān)的文件下載百度云里面的，其他網(wǎng)站的好像都不能用，自己改了一下之前的腳本可以正常運(yùn)行

misa 相關(guān)文件放在百度云鏈接：https://pan.baidu.com/s/1C4eU30yyLr7iNGiuGEmPtg
提取碼：dypg
文件包括misa.ini(參數(shù)設(shè)置), misa.pl(perl腳本)，p3_in.pl，p3_out.pl

misa.ini為SSR鑒定參數(shù)，默認(rèn)：
definition(unit_size,min_repeats):1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
interruptions(max_difference_for_2_SSRs):100
參數(shù)說(shuō)明：1個(gè)堿基重復(fù)10次及10次以上；2個(gè)堿基重復(fù)6次及6次以上；3個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上；4個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上；5個(gè)堿基重復(fù)5次及5次以上；6堿基重復(fù)5次及5次以上的堿基重復(fù)序列算是微衛(wèi)星序列。兩個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100bp的時(shí)候，兩個(gè)微衛(wèi)星組成一個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。

perl misa.pl test.fa  
perl p3_in.pl test.fa.misa
##### primer3 設(shè)計(jì)引物
primer3_core -- default_version=1 -- output=test.fa.p3out test.fa.p3in
#### p3_out.pl 整理合并文件
perl p3_out.pl test.fa.p3out test.fa.misa

一對(duì)好引物的特征
1.GC含量 40-60%
2.退火溫度 50-65℃
3.3'端最后5個(gè)堿基有G或C,但是不超過(guò)3個(gè)
4.引物長(zhǎng)度推薦 17-28bp，最好不超過(guò) 30bp

一般而言，單堿基，四，五，六堿基的引物都不用，使用的一般是二堿基重復(fù)次數(shù)10次以上，三堿基重復(fù)次數(shù)6次以上的SSR