前言
細胞的生命活動受多種蛋白質的時空動態調控，這種動態組織和調控失衡會導致許多人類疾病，因此有必要認識細胞中蛋白質的時空組織和動態調控機理。目前，盡管一系列研究在這方面已經取得較大的進展，但是這些方法只能在遺傳可編碼性和動態控制中滿足其一，無法概述細胞的自組織特點，因而無法模擬細胞生物學的核心編程語言。
2024年1月18日，來自威斯康星大學麥迪遜分校的多名學者，針對大腸桿菌（E.coli）的MinDE線路在Cell (lF=64.5) 雜志上發表了題為"A programmable reaction-diffusion system for spatiotemporal cell signaling circuit design"的研究論文，提出了一個可編程的反應擴散平臺。該研究根據反應擴散系統的理論模型，利用細菌的位置線路——MinDE與真核系統正交，從而在人體細胞內實現蛋白的反應擴散系統。
研究證實了MinDE 線路在后生動物生物學中有很多應用。這些包括利用振蕩蛋白質動力學作為“細胞無線電信號”，在頻域中對細胞身份和結構進行條形碼編碼；使用這些信號來編碼和散播亞細胞動力學；以及通過一系列時空動力學對下游細胞活動進行模式化等。MinDE 線路的模塊化和他們可以嵌入到合成生物學范式的簡便性提供了一套可視化、探測和擾動細胞生物學的工具。
結果解讀
1.MinDE在哺乳動物細胞中生成了多種時空蛋白質模式
細菌的分裂由質膜表面的極對極蛋白的振蕩決定，而這個振蕩為一個反應擴散過程：MinD蛋白為一種ATPase，結合ATP的時候位于細菌質膜上；MinE為它的輔激活因子，游離與胞漿中，當結合MinD時會促使MinD催化ATP水解，然后MinDE分開并從質膜解離（圖1A）。據此，研究者在哺乳動物細胞如3T3、U2OS細胞系中構建了mCherry-MinD和MinE-GFP表達系統，并且使用間隔拍攝熒光顯微鏡對熒光分布進行成像。結果發現，MinD和MinE在細胞中呈現出多種分布模式（圖1B-E）。
在U2OS細胞系中，一部分細胞呈現出行波模式，MinD和MinE的強度呈現出周期性振蕩，其中MinD的相位稍落后于MinE（圖1C）；一部分細胞呈現出駐波振蕩，即MinD和MinE的強度以幾乎恒定的振幅快速振蕩，MinE往往分布在MinD的周圍（圖1D）;一部分細胞呈現持續平穩模式，MinE完全包裹MinD形成一個個小球，每個小球的最近鄰距離服從均值為5.8μm的正態分布（圖1E）。這表明MinDE系統在哺乳動物細胞中也服從預期的雙組份反應擴散系統。
2.合成MinDE模式和信號在遺傳和生化水平是可編程的
由于每一時刻都能拍出一張成像照片，而每張照片的每個像素表示的是該時刻MinD和MinE的強度，那么對于每個像素點在時域內都能做出一個MinD和MinE強度隨時間振蕩的曲線圖；將這些振蕩圖經過傅里葉變換（FFT）就能得到頻域中像素點振幅與頻率的關系圖，在頻域上以振幅作為每個像素點灰度值，就可以得到依頻率排列的圖堆棧。其中這個細胞圖片中的大量像素點在某一頻率處有振幅峰值，這個頻率就稱為該細胞的MinDE頻率（）（圖2A）。相場圖反應了細胞內各個部位的相位差，延其中一條軌跡能繪制出相位差隨距離的變化情況（圖2B）。
為了研究MinDE的基因表達量和它們的強度振蕩之間的關系，研究者對于mCherry-MinD和MinE-GFP進行了數千次成像，并使用平均GFP和mCherry強度代替MinE和MinD表達量（圖2C）。研究者發現MinDE的振蕩頻率與MinE:MinD的比例呈正相關（圖2D），并且MinE具有更快膜交換的突變形式，如L4E和F6E，能產生更高的頻率（圖2E）。而MinDE的振幅則主要又MinD的表達量決定，MinD表達量越高，振幅越大（圖2F），并且還受到螺旋中心的密度的影響（圖2G）。這些結果表明，MinDE是一種基因編碼的動態蛋白質模式系統，其輸出行為可以在遺傳和生化水平進行調整和調節，這提供了一個起始的合成生物學模塊。
3.MinDE信號在頻域中將細胞身份和亞細胞結構標記為條形碼
由于每個細胞產生的MinDE振蕩波各不相同，因此可以使用MinDE信號作為“細胞無線電”；這些信號可以通過FFT、有限脈沖響應（FIR）濾波器、希爾伯特變換（HT）和連續小波變換（CWT）進行處理和解析，進而可以區分出單細胞和亞細胞結構（圖3A）。在時域內堆棧的熒光圖像，經過FFT以后得到在頻域內堆棧的振幅圖像，因而可以判斷出每個細胞的（圖3B）。根據不同細胞的進行著色，則可將不同頻率的細胞區分開（圖3C）。為了觀察細胞分裂的過程中頻率的變化，研究者以30min為單位對3T3細胞繪制了細胞頻率圖，并將其在24h的時間尺度上排列起來（圖3D）。發現大多數細胞的頻率都比較恒定，波動維持在一定范圍內（圖3E、F）。在亞細胞尺度上，細胞核和細胞質的MinDE頻率也有一定的區別，這種區別能被激光共聚焦顯微鏡觀察到，并且通過對頻率著色能更清楚地表示這種差別（圖3G）。
在低倍率寬視場成像中，這些微弱的核振蕩在肉眼下并不明顯（圖3H），但是經過FFT能分辨出細胞質和細胞核的頻率（圖3I），然后通過FIR濾波器分離每個像素核和細胞質的信號，通過HT進行多通道分解，恢復這些信號的瞬時振幅（圖3J），進而得到亞細胞結構隨時間的動態變化（圖3M）。這個過程也可以被另一過程代替：時域圖像經過連續小波變換得到每一個像素點的頻率隨時間的變化情況（圖3K），嶺提取算法可以自動檢測、跟蹤和分離數據中有意義的信號，也能得到每一個像素點的瞬時振幅（圖3L）。因此，MinDE線路產生的信號為合成蛋白質動力學中編碼單細胞和亞細胞信息提供了前所未有的潛力，這些信息可以使用一套強大的數字信號處理工具輕松解碼。
4.工程化的MinDE線路標條碼和散播單細胞信號動態
為了研究MinDE對細胞內蛋白狀態的檢測作用，研究者設計了一種工程化的MinDE線路，這個線路設計了MinD-PKA和FHA1-mCerulean融合蛋白，其中FHA1為磷酸化PKA的reader，因此通過檢測MinDE和FHA1的波動信號即可反應PKA的磷酸化水平（圖4A）。在初始狀態下，PKA的磷酸化水平很低，所以FHA1的信號不隨MinDE發生明顯的波動，加入PKA激動劑異丙腎上腺素后，PKA被激活，使得FHA1識別磷酸化的PKA，其信號隨著MinDE發生波動（圖4B、C），研究者用FHA1的振幅和MinDE的振幅之比作為歸一化因素，反應PKA的活性大小（圖4C）。由于不同的細胞具有不同的MinDE頻率（圖4D），對每個細胞按頻率進行著色后，比較加激動劑前后PKA振幅的相對值，即可得出各個細胞中PKA的活性變化（圖4E），通過層次聚類可以得出細胞中PKA活性變化的幾種模式（圖4F）。
5.MinDE控制的信號線路可以時空重組宿主的細胞生物學
為了研究MinDE對細胞內蛋白的調節作用，研究者構建了一個即插即用的平臺，即構建了MinD-FRB和FKBP-載荷蛋白的融合蛋白，而加入雷帕霉素（rap）會導致FRB和FKBP的結合，從而可以使得載荷蛋白隨著MinDE發生波動（圖5A）。研究者以BFP作為載荷蛋白的例子，發現加入雷帕霉素前，載荷蛋白BFP幾乎均勻分布在細胞質中，而在加入雷帕霉素30s后，BFP和MinDE已經有了明顯的共定位（圖5B）。在時域上，加入雷帕霉素前BFP幾乎不展現出波動信號，加入雷帕霉素30s后BFP展現出與MinDE同頻的波動（圖5C），并且在頻域上也能看出加入雷帕霉素30s后相比加入前在處振幅增加了13倍（圖5D）。但是BFP對于MinDE的頻率隨MinE:MinD的改變沒有影響（圖5E）。
為了研究載荷蛋白對于MinDE振蕩的影響，研究者使用誘導驅動的蛋白質縮合（IDR）作為載荷蛋白，以觀察在IDR的過程中MinDE振蕩周期的變化（圖6A），發現MinDE分別與弱IDR的RGG、中等強度IDR的FUSN和強IDR的DDX4結合后，振蕩頻率出現了不同程度的降低（圖6B-D），當MinDE與預形成蛋白質液滴的載荷蛋白FTH-FUSN結合時，MinDE立即停止振蕩（圖6E）。
為了研究MinDE對于細胞內通路的調控作用，研究者使用ActA作為載荷蛋白，而ActA會激活下游信號通路，導致微絲的聚合，這可以被LifeAct-GFP檢測到（圖6F）。當ActA與平穩模式的MinDE結合并且加入rap后，LifeAct呈現出與MinD的共定位（圖6G）。當ActA與行波狀態的MinDE結合后，LifeAct振蕩的相位落后于MinD約8s（圖6H-J），據此可以推算通路傳遞的時間。
總結
本篇研究利用熒光成像結合一些信號處理技術揭示了細菌中的反應擴散系統MinDE的機理。并且設計了MinDE這一個可編程的合成生物學模塊，將其應用于細胞和亞細胞結構的識別（圖7A），細胞內蛋白的檢測（圖7B）和對于細胞內生命活動的調控（圖7C）。
文章主要研究思路如下：
- 細菌中的MinDE可以導入到哺乳動物細胞中，并且表現出多種周期性振蕩模式；
- 這種振蕩模式可以通過FFT映射到頻域和相場中，并且其與的相對表達量有關；
- 根據每種細胞和亞細胞結構的MinDE頻率可以將其區分開；
- MinDE系統可以用于檢測細胞內蛋白質的活性；
- 即插即用的MinDE平臺可以用于調控細胞內蛋白的定位；6.最后，這個平臺的振蕩也會受到細胞內蛋白質聚合的影響，并且可用于調控細胞內信號通路。
總的來說，這項研究建立了一個合成生物學模塊，可以用于觀測、解析和調控細胞內蛋白質的狀態。本文邏輯清晰，設計思路值得研究合成生物學的小伙伴借鑒。同時，該研究也指出了一些局限性，如觀測的時間尺度還不夠大，相同頻率的細胞難以分離，模型在亞細胞結構的分辨率還不夠高等問題。
