Integrated analysis of transcriptomics, proteomics and metabolomics data reveals the role of SLC39A1 in renal cell carcinoma
轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學數據的綜合分析揭示了SLC39A1在腎細胞癌中的作用
發表期刊：Front Cell Dev Biol
發表日期：2022 Nov 3
影響因子：6.081
DOI:? 10.3389/fcell.2022.977960
一、研究背景
????????腎細胞癌（RCC）是最普遍的腎臟惡性腫瘤，在2021年所有估計的癌癥病例中排名第八。對致癌分子機制的模糊認識和轉移后對化放療的不敏感，導致RCC患者的臨床管理效率低下。
????????最近，越來越多的證據表明，腫瘤的發生與代謝途徑的錯綜復雜的變化之間的關系，這就是所謂的代謝重編程。Warburg效應是腫瘤代謝重編程的一個新標志，指的是無論線粒體是否正常和氧氣是否充足，腫瘤細胞都容易增加葡萄糖的吸收并促進其轉化為乳酸的現象。癌細胞中的糖酵解開關允許糖酵解中間代謝物參與體內核苷酸和氨基酸的合成，因此，維持了腫瘤的長期生長、增殖和生存。
????????SLC39A1，也被稱為ZIP1，負責將鋅離子轉移到細胞中。在ZIP家族中有14個蛋白成員。ZIP蛋白中有8個跨膜結構域，鋅的轉運被認為與位于結構域III和IV之間的細胞內環有關。
二、材料與方法
1、數據來源
OSRC-2細胞
2、分析流程
1） 細胞培養、細胞轉染、Western blotting檢測、RNA提取和定量實時PCR檢測
2） 轉錄組學分析：RNA提取和RNA檢測；用Illumina HiSeq高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序；用DESeq篩選差異表達基因（DEGs）；使用R語言Pheatmap軟件包對樣本的所有不同基因進行雙向聚類分析；根據不同樣品中同一基因的表達水平和同一樣品中不同基因的表達模式，用歐氏方法計算距離，用完全連鎖法進行聚類；使用疾病本體論（DO）和DisGeNET數據庫來發現有DEGs改變的人類疾病
3） 蛋白質組學分析：樣品制備；LC-MS/MS分析
4） 代謝組學分析：樣品制備和提取；T3 UPLC；QTOF-MS/MS；ESI-Q；MS/MS的質量控制；代謝物的定性和定量；PCA、層次聚類分析和Pearson相關系數 PCA（主成分分析）由R（www.r-project.org）內的統計函數prcomp進行；差異性代謝物的選擇
5） 通過Cytoscape構建基因、蛋白質和代謝化合物的網絡，以確定DEGs顯著富集的路徑，并揭示基因和代謝物之間的潛在調控機制
6） 統計分析和生物信息學分析：GO、KEGG和COG數據庫被用于蛋白質功能注釋；InterPro數據庫和MultiLoc2分別用于領域注釋和亞細胞定位分析；KEGG、GO和Reactome數據庫顯示了參與差異基因的信號轉導途徑；DO和DisGeNET數據庫被用來揭示與差異基因相關的人類疾病；HMDB數據庫提出了由差異性代謝物富集的人類代謝、代謝性疾病途徑、代謝物信號傳導和藥物活性途徑；MESA分析使用來自MebaboAnalyst的代謝物數據庫進行
三、實驗結果
01 - SLC39A1-過表達的OSRC-2腎癌細胞的轉錄組學分析結果
????????兩組OSRC-2細胞（NC和ZIP）分別轉染了空載體和SLC39A1載體。然后進行rt-PCR檢測和Western blot檢測以測試轉染效率。SLC39A1過表達后有321個DEGs，其中71個上調，250個下調（圖1A）。使用KEGG數據庫來解釋受DEGs影響的具體分子功能。總共發現16條KEGG途徑被富集，包括煙酸和煙酰胺代謝、補體和凝血級聯、中性粒細胞胞外陷阱形成、谷胱甘肽代謝、金黃色葡萄球菌感染等。隨后，通過將DEGs與GO數據庫中的三個功能詞進行映射，將可能受SLC39A1調控的基因映射到生物過程（BP）中，分別為細胞外結構組織、多細胞機體平衡、氨基酸跨質膜導入、細胞基質組織和傷口愈合；細胞成分（CC）為細胞基質、細胞頂端部分、基底質膜和頂端質膜；分子功能（MF）為肽結合（圖1B）。此外，Reactome數據庫整合了各種反應和生物途徑，結果顯示了纖維蛋白凝塊形成、膠原蛋白降解和整合素細胞表面相互作用方面的突出變化（圖1C）。DO數據庫能夠提供與人類基因功能和疾病有關的數據，DisGeNET數據庫整合了與人類疾病有關的基因。SLC39A1引發了與泌尿系統和腎臟疾病、肺部疾病、動脈硬化和胃癌有關的基因的明顯改變（圖1D）。此外，DisGeNET分析結果表明，SLC39A1在與補體因子I（C3失活劑）缺乏、缺血性中風、絨毛膜癌和高血壓病有關的基因中引起了顯著的變化。此外，在差異表達的基因中，還發現了SLC39A1的一個已知的相互作用蛋白。親和捕獲MS證實，被SLC39A1顯著下調的補全C5a受體1(complete C5a receiver 1, C5AR1)與SLC39A1直接相互作用
02 - SLC39A1過表達的OSRC-2腎癌細胞的蛋白質組學分析結果
????????火山圖綜合顯示了2組之間蛋白質表達水平的明顯差異，共鑒定了324個蛋白質，其中124個上調，200個下調（補充圖S3A）。KEGG富集分析顯示了信號轉導途徑和代謝過程的改變，其中涉及不同的蛋白質。氣泡圖顯示了PI3K-Akt信號通路、PPAR信號通路、補體和凝血級聯以及鐵蛋白的明顯富集（圖2A）。在GO富集分析中，差異蛋白被映射到GO數據庫中的三個術語，以定義它們的主要生物學功能。餅狀圖顯示，SLC39A1可能調節的生物過程（BP）包括但不限于：對無機物的反應、蛋白酶體泛素無關的蛋白質分解過程、上皮細胞的形態發生（圖2B）。SLC39A1還代表了對分子功能（MF）的重大影響，如信號受體結合、氧化還原酶活性、輔助因子結合、細胞外基質結構成分（圖2C）。此外，SLC39A1可能有助于細胞成分（CC）的形成，包括分泌顆粒和囊泡、含膠原的細胞外基質和蛋白酶體復合物（圖2D）。正統蛋白質群（COG/KOG）富集分析顯示SLC39A1與OSRC-2細胞中的核苷酸運輸和代謝、代謝細胞外結構和無機離子運輸有關（圖2E）。兩組之間的差異可能是源于不同結構域的功能或定位。亞細胞定位分析明確了差異蛋白的具體細胞定位，這與蛋白的功能密切相關。差異蛋白主要分布在細胞質、核和ER（補充圖S3B）。而結構域富集分析顯示，差異蛋白的結構域主要包含蛋白酶體亞單位A/B和EGF樣結構域（補充圖S3C）。
03 - SLC39A1-過表達的OSRC-2腎癌細胞的代謝組學分析結果
????????對RCC細胞樣本的代謝組學數據進行了分析，以評估其代謝差異。主成分分析（PCA）和正交部分最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）顯示了兩組之間的綜合代謝變化。PCA（圖3A）和OPLS-DA（圖3B）的得分圖見證了明顯的分離，表明SLC39A1對RCC的代謝造成了明顯的干擾。60個重要的差異性代謝物被過濾出來，根據KEGG數據庫對差異代謝物的功能注釋，按照KEGG途徑類型進行分類，發現多種代謝變異：嘌呤代謝、嘧啶代謝、半乳糖代謝、谷胱甘肽代謝和cAMP信號途徑（圖3C）。MSEA富集分析能夠防止遺漏具有重要生物學意義的不明顯的差異表達代謝物。分析表明，SLC39A1在MSEA中引發了50多個代謝組的改變（圖3D）。此外，人類代謝組數據庫（HMDB）的富集分析顯示，SLC39A1還對精氨酸和精胺的生物合成、乳糖的生物合成、GLUT-1缺陷綜合征和先天性糖基化障礙CDG IId具有明顯的影響（圖3E）。然后選擇涉及不少于5個差異性代謝物的途徑進行聚類分析。熱圖顯示SLC39A1調節的代謝物被聚類在核苷酸及其代謝組、糖及其衍生物、小肽和有機酸中（圖4A）。
04 - 綜合蛋白質組學、轉錄組學和代謝組學數據
????????轉錄組學和蛋白質組學數據描述了蛋白質和基因之間的關系。維恩圖表明，共有8個蛋白質在mRNA和蛋白質水平上有差異表達。熱圖顯示了8個蛋白質的調節類型之間的對應關系（圖4B）。
????????基于蛋白質組學、轉錄組學和代謝組學數據的綜合分析解釋了不同表達的代謝物和基因之間的潛在相關性。通過將差異基因和代謝物映射到KEGG途徑上進行富集分析。SLC39A1引起了腎癌細胞代謝途徑的明顯紊亂，改變了71個基因的轉錄和翻譯水平。幾種物質的代謝受到明顯影響：嘌呤代謝、嘧啶代謝、多種氨基酸代謝、乳糖代謝和游離脂肪酸代謝。綜合數據分析表明，SLC39A1豐度的增加引起了明顯的代謝重編程。
????????在核苷酸代謝中，觀察到尿苷、UMP的明顯下調，以及2′-脫氧肌苷的上調（圖5A）。相應地，嘧啶和嘌呤代謝中的酶也發生了變化：磷酸二酯酶2A（PDE2A）、腺苷酸激酶6（AK6）、二氫嘧啶脫氫酶（DPYD）、脫氧胞苷激酶（DCK）表達減少，鳥苷酸環化酶1可溶性亞單位α1（GUCY1A1/GCYA1）增加（圖5B）。半乳糖的代謝也發生了轉變，其中乳糖和乳木糖減少（圖5A）。醛酮還原酶家族1成員B（AKR1B1）和半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶（GALT）被消耗，半乳糖變異酶（GALM）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）被激活（圖5B）。在氨基酸和肽的代謝方面，SLC39A1減少了RCC細胞中的蛋氨酸，并降低了半胱氨酸γ-解酶（CTH）的水平（圖5A）。SLC39A1也參與了GSH代謝，減少了精氨酸的產生（圖5A）。SLC39A1下調CHAC1（γ-GCTs，谷胱甘肽特異性降解酶）和異檸檬酸脫氫酶樣蛋白（IDHP），同時促進N-乙酰轉移酶8（NAT8）（圖5B）。在脂質代謝方面，SLC39A1明顯增加了游離脂肪酸（圖5A），硬脂酰-CoA去飽和酶（SCD）表達水平增加（圖5B）。
????????SLC39A1已被證明可以調節與腫瘤發生和發展密切相關的信號轉導途徑中的關鍵基因，涉及PI3K-AKT信號途徑、cAMP信號途徑、PPAR信號途徑和鐵中毒。在PI3K-AKT途徑中，SLC39A1減少了成熟T細胞增殖1（MTCP1），下調了AKT下游因子：cAMP反應元件結合蛋白（CREB）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（CDN1B），但上調了I-κB激酶β（IKKβ）。在cAMP信號途徑中，鈣/鈣蛋白依賴性蛋白激酶II伽馬（CaMK）活性被激活。由cAMP直接激活的交換蛋白（Epac）和PKA表達被上調。在PPAR信號途徑中，脂肪酸結合蛋白（FABP）、SCD和酰基-CoA合成酶長鏈（ACSL）被上調，而血管生成素樣4（ANGPTL4）、周脂素2（PLIN2）和酰基-CoA氧化酶（ACOX）的表達降低。此外，SLC39A1對鐵中毒相關因素也有重要的調節作用：溶質載體家族7成員11（SLC7A11）、核受體輔助因子4（NCOA4）、血紅素氧合酶1（HO-1）和鐵蛋白的表達減少，而阿凱特-斯庫特家族bHLH轉錄因子4（ASCL4）和腦漿蛋白（CP）的表達被激活（圖5C）。
????????為了更直觀地展示差異基因、蛋白質和差異代謝物之間的聯系，用Cytoscape描繪了一個相關網絡（圖6）。差異基因和蛋白質在嘌呤和嘧啶代謝、乳糖代謝以及谷胱甘肽和蛋氨酸代謝中引起了明顯的干擾。酶（如PDE2A、DPYD、DCK、AKR1B1、CHAC1、CTH等）的mRNA或蛋白水平的變化引發了幾種代謝物的改變：尿苷、脫氧肌苷、精氨酸、蛋氨酸、乳糖，這與上述結果一致。
四、結論
????????本研究表明，SLC39A1在RCC中發揮著腫瘤抑制因子的作用。綜合轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學數據表明，SLC39A1的抗腫瘤作用可能與嘌呤和嘧啶代謝、谷胱甘肽代謝和鐵中毒、ROS的產生、PI3K-AKT、cCAMP-Epac和PPAR信號途徑的改變有關。然而，在SLC39A1抑制腫瘤進展的過程中，Zn2+是否是一個不可缺少的中間環節仍有待探討。
