4 、天閑星 入云龍 公孫勝
下面是聯(lián)川生物錢(qián)創(chuàng)的分享
發(fā)表時(shí)間：2020年5月
期刊：Genome Medicine (IF:10.675)
單位：韓國(guó)成均館大學(xué)
技術(shù)手段：10x Chromium單細(xì)胞、WES、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、PDX模型
前言
肌肉侵襲性尿路上皮膀胱癌(MIUBCs)具有臨床侵襲性和致命性，由于其全身擴(kuò)散的可能性很高，且缺乏完善的治療指南，MIUBCs的 5年相對(duì)生存率只有5%。MIUBCs存在瘤內(nèi)和瘤間異質(zhì)性(遺傳、分子和微環(huán)境)，且TME會(huì)導(dǎo)致MIUBCs的治療失敗和腫瘤進(jìn)化，因此針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制和復(fù)雜相互作用的個(gè)性化干預(yù)設(shè)計(jì)成為必要。
傳統(tǒng)的bulk測(cè)序在解決腫瘤細(xì)胞亞群和解析TME的能力上存在局限性，而scRNAseq技術(shù)可以對(duì)治療后殘留的腫瘤細(xì)胞和周?chē)|(zhì)中腫瘤相關(guān)的非惡性細(xì)胞的基因模塊進(jìn)行高分辨率分析，解剖關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)途徑，以設(shè)計(jì)針對(duì)腫瘤細(xì)胞和TME的定制聯(lián)合治療方案。PDXs中的基質(zhì)和免疫細(xì)胞成分可用于模擬人類(lèi)腫瘤組織TME，基于PDX模型的物種特異性分析是區(qū)分TME(小鼠)和腫瘤細(xì)胞(人)的最簡(jiǎn)單方法之一。在本研究中，研究人員切除了一位化療耐藥的轉(zhuǎn)移性MIUBC患者的原發(fā)腫瘤并構(gòu)建PDX模型，利用scRNA-seq深入分析了難治性癌癥的多種機(jī)制，為針對(duì)癌基因依賴之后制定的一種規(guī)避腫瘤進(jìn)展的治療選擇提供了重要線索，并在患者中成功應(yīng)用。
結(jié)果
1、 患者臨床信息
病人為49歲男性患者，第一次經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)診斷為非肌肉侵襲性膀胱移行細(xì)胞癌（non-MIUBC）(pT1, high grade)，第二次經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤已經(jīng)進(jìn)展為肌肉侵襲性膀胱移行細(xì)胞癌（MIUBC）(pT2, high grade)，經(jīng)過(guò)多種新輔助化療（吉西他濱/紫杉醇、連續(xù)紫杉醇）后，出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和多發(fā)性肺轉(zhuǎn)移,表明腫瘤進(jìn)展為鉑難治轉(zhuǎn)移性MIUBC，對(duì)其有效的全身治療選擇有限。三次手術(shù)獲得的樣本分別編號(hào)為BC159-T#1、BC159-T#2、BC159-T#3（下圖）。
2、 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
BC159-T#1、BC159-T#2兩個(gè)樣本用于做全外顯子測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，BC159-T#3樣本一部分用于做全外顯子測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，一部分解離為單細(xì)胞用于單細(xì)胞測(cè)序和PDX模型構(gòu)建，荷瘤小鼠(100-150mm3)隨機(jī)分為替吡法尼(50mg/kg，灌胃，每日2次)組和對(duì)照組，治療20天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集各組腫瘤用于單細(xì)胞測(cè)序等其他分析（下圖）。
3、 臨床樣本信息分析
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和IHC發(fā)現(xiàn)樣本BC159-T#1富集luminal–papillary腫瘤亞型基因信號(hào)（例如CK13），BC159-T#2和BC159-T#3表現(xiàn)出basal/squamous 腫瘤亞型特征（例如CK5/6和CK14），這些數(shù)據(jù)與已知的MIUBC從管腔亞型到基底鱗狀亞型的進(jìn)展路徑一致，這表明腫瘤通過(guò)增加stemness和上皮-間充質(zhì)過(guò)渡(EMT)增強(qiáng)了臨床侵襲性（下圖）。
為了識(shí)別腫瘤進(jìn)化樹(shù)中普遍存在的癌基因依賴和驅(qū)動(dòng)突變，對(duì)BC159-T#1~#3進(jìn)行全外測(cè)序（WES）進(jìn)行SNP分析和CNV分析，并使用OncoKB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些突變做了靶向藥物注釋。
三個(gè)樣本中HARS表現(xiàn)出最高程度的變異等位基因頻率（VAF）,并伴隨HRASQ61R突變蛋白高表達(dá)和RAS通路高度激活，單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)一步表明HRAS在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，提示HRASQ61R是這例晚期難治性病例中驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)展的主要因素。**
4、 阻斷HRASQ61R活化后治療效果的臨床前驗(yàn)證及臨床應(yīng)用
為了驗(yàn)證靶向HRAS的治療可能是患者的臨床選擇，使用了BC159-T#3皮下PDX模型開(kāi)展替吡法尼臨床前驗(yàn)證：當(dāng)替吡法尼(50mg/kg口服，每天兩次)在藥理上抑制HRAS激活時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制、HRAS介導(dǎo)的ERK和AKT激活降低、細(xì)胞增殖減少、凋亡增加
備注：替吡法尼是一種高效選擇性法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)，通過(guò)顯著衰減法酰化介導(dǎo)的HRAS信號(hào)，對(duì)含有突變HRAS的晚期MIUBCs特別有效
基于替吡法尼具有良好的臨床前抗腫瘤療效，患者經(jīng)膀胱部分切除術(shù)后參加了替吡法尼II期臨床試驗(yàn)，經(jīng)治療后患者膀胱、左腎盞及肺轉(zhuǎn)移腫瘤負(fù)荷明顯減輕(部分緩解）。但是遺憾的是，與PDX臨床前試驗(yàn)中替吡法尼未能完全緩解腫瘤一致，患者消散性腫瘤在9個(gè)月后開(kāi)始再生（下圖）。（PS: 小編建議可以嘗試類(lèi)器官這個(gè)技術(shù)，目前主流科學(xué)界認(rèn)為它優(yōu)于PDX模型）
5、 scRNA-seq闡明靶向HRAS單治療后腫瘤耐藥的細(xì)胞內(nèi)在因素
通過(guò)對(duì)PDX樣本（替吡法尼處理前后）單細(xì)胞測(cè)序，將腫瘤細(xì)胞分為A、B兩個(gè)cluster，其中替吡法尼治療后，腫瘤細(xì)胞中HRAS以及RAS、MAPK通路相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，蛋白水平（單細(xì)胞WB）證明HRAS介導(dǎo)的信號(hào)通路受抑制。
有意思的是，替吡法尼耐受腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞休眠狀態(tài)（非增殖細(xì)胞比例增加），這有助于抵抗靶向細(xì)胞增殖的藥物。耐藥腫瘤細(xì)胞中，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP7)、肝素結(jié)合細(xì)胞因子(MDK)和beta -2微球蛋白(B2M)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)水平升高（下圖）。
為證明治療開(kāi)始前腫瘤組織就存在假定的替吡法尼耐受腫瘤細(xì)胞，對(duì)治療前腫瘤樣本（BC159-T#3）進(jìn)行單細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)治療前腫瘤細(xì)胞可聚類(lèi)為3個(gè)cluster，其中cluster3表現(xiàn)出HRAS轉(zhuǎn)錄下調(diào)、細(xì)胞休眠和IGFBP7、MDK、B2M 高表達(dá)（下圖）。
6、單細(xì)胞測(cè)序分析TME對(duì)替吡法尼獲得性耐藥的貢獻(xiàn)
治療誘導(dǎo)的TME改變會(huì)為癌細(xì)胞生成一個(gè)保護(hù)小生境，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展。為了闡明TME因素對(duì)替吡法尼耐藥的誘導(dǎo)，研究人員采用單細(xì)胞測(cè)序分析了PDX組小鼠在替吡法尼處理前后TME的變化，聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)小鼠PDX的TME成分包括成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞以及自然殺傷(NK)細(xì)胞。
雖然替吡法尼引起的整體細(xì)胞成分改變很小，但對(duì)每個(gè)細(xì)胞成分的詳細(xì)分析揭示了替吡法尼治療后特定細(xì)胞亞型的改變。成纖維細(xì)胞包括癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs，表達(dá)COL14A1)和癌相關(guān)肌成纖維細(xì)胞(MyoCAFs，表達(dá)ACTA2)，替吡法尼治療后MyoCAFs的數(shù)量增加，而MyoCAFs通常與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后有關(guān)，對(duì)照組含有更多的CAFs。差異基因分析發(fā)現(xiàn)，Mdk和Igfbp7（與替吡法尼耐受相關(guān)的腫瘤內(nèi)在因子）在替吡法尼處理組成纖維細(xì)胞高表達(dá)，這意味著這兩個(gè)靶點(diǎn)在休眠腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，MyoCAF亞群與腫瘤細(xì)胞的互作可能有助于腫瘤對(duì)替吡法尼的耐藥性（下圖）。
另外發(fā)現(xiàn)，替吡法尼治療導(dǎo)致巨噬細(xì)胞總數(shù)和比例顯著增加，伴隨M1樣巨噬細(xì)胞減少和M2樣巨噬細(xì)胞增加；處理組中耗竭型CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)和自適應(yīng)NK細(xì)胞增多，表達(dá)IgM的B細(xì)胞減少。總的來(lái)說(shuō)，替吡法尼誘導(dǎo)的TME特征是促腫瘤的MyoCAFs浸潤(rùn)增加，免疫細(xì)胞受抑制，例如M2巨噬細(xì)胞增加和CTLs耗竭（下圖）。
對(duì)BC159-T#3臨床腫瘤樣本TME進(jìn)行單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)臨床樣本細(xì)胞構(gòu)成與PDX模型TME類(lèi)似。重要的是，在BC159-T#3中，存在包括Navie到激活狀態(tài)的CTLs和 Tregs細(xì)胞。激活的CTLs和Tregs均表達(dá)不同水平的免疫檢查點(diǎn)基因，如CTLA4、LAG3、PDCD1TIGIT。綜合臨床樣本數(shù)據(jù)和PDX模型替吡法尼治療前后數(shù)據(jù)，預(yù)示抑制肌成纖維細(xì)胞和抗炎巨噬細(xì)胞，或重新激活T細(xì)胞免疫，可以考慮作為治療抗替吡法尼MIUBC的策略。
7、 針對(duì)替吡法尼治療后腫瘤復(fù)發(fā)的個(gè)體化搶救方案
目前還沒(méi)有通過(guò)抑制MDK和IGFBP7共同靶向休眠腫瘤細(xì)胞和MyoCAFs的治療方法。然而PD-1)/PD-L1抑制劑被批準(zhǔn)用于晚期化療難治性MIUBC的二線治療，BC159-T#3中浸潤(rùn)的耗盡CTLs和Tregs中過(guò)表達(dá)PD-1/PD-L1，因此PD-1/PD-L1抑制劑在臨床上可能是有效的。
BC159-T#3中腫瘤細(xì)胞和多種基質(zhì)/免疫細(xì)胞之間存在細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1 和PVR轉(zhuǎn)錄本分別通過(guò)PD-1 和TIGIT向 T細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)。BC159-T#3樣本中PD-1表達(dá)位居TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集的前3.16%，與其他亞型(特別是含有HRAS突變的亞型)相比，基底亞型中PDL1的表達(dá)較高，進(jìn)一步證實(shí)了BC159-T#3中PD1高表達(dá)。由于PDL1的高表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)對(duì)PD-1/PD-l1抑制劑的良好臨床反應(yīng)，因此對(duì)替吡法尼治療失敗的患者使用人源化的單克隆PDL1抗體阿特唑珠單抗作為替吡法尼治療后復(fù)發(fā)腫瘤的下一個(gè)優(yōu)化治療選擇，成像顯示，如預(yù)期的那樣，受試者對(duì)阿特唑珠單抗有部分反應(yīng)。
結(jié)論
由于過(guò)程復(fù)雜且昂貴，PDXs構(gòu)建和scRNA-seq目前還無(wú)法應(yīng)用于實(shí)際臨床。即使在極少數(shù)成功應(yīng)用的情況下，因?yàn)椴∪说慕】笛杆賽夯瑢?dǎo)致無(wú)法分析潛在的聯(lián)合治療策略的臨床反應(yīng)，這些局限性使得本研究更有價(jià)值，因?yàn)榇搜芯炕赑DX和scRNA-seq數(shù)據(jù)來(lái)確認(rèn)治療選擇的有效性。更重要的是，本文的發(fā)現(xiàn)可能對(duì)攜帶HRAS突變的癌癥患者具有普遍的適用性。本文的發(fā)現(xiàn)顯示了在傳統(tǒng)單一療法治療失敗后，scRNA-seq發(fā)現(xiàn)新的精確治療方案的潛力，也為臨床上一系列難治性晚期癌癥的有效個(gè)性化治療提供了新的見(jiàn)解。
