不知道大家有沒有發現，免疫的研究是單細胞空間的繞不開的話題，其實從我們認知的情況下，免疫細胞受到時空微環境的影響，單細胞識別的T細胞在不同的空間區域也是會有不同的轉錄圖譜，可見，很多的研究都需要結合單細胞空間聯合起來進行表征，這一次我們的參考文獻在Regional Cell Atlas of Human Intestine Shapes Distinct Immune Surveillance，每次讀一些東西，對其認識都會深入一些。
其實關于組織細胞的微環境，單細胞分析得到了大量的表征，但這個分析是建立在損失了空間信息的基礎之上，所以對于細胞因位置導致的轉錄變化無法獲得，所以就需要空間轉錄組的信息所謂補充，但是如果單單從空間轉錄組出發，精度的問題始終是無法真正克服，也無法得到很詳細的表征信息，所以這些研究，都需要結合單細胞空間兩種技術，才能真正解決生物學問題。
Abstract
區域腸道免疫監測仍然沒有明確的定論。在這項研究中，整合了單細胞 RNA 測序和空間轉錄組學，創建了一個胎兒和成人腸道區域圖譜，由 59 個細胞亞群組成，其中確定了 8 個新亞群和 ILC 過渡態。結果表明，微環境決定了原位細胞分化并塑造了區域分子特征，使不同的腸段具有不同的功能。對mucins、免疫球蛋白和抗菌肽 (AMP) 的區域表達及其在發育和炎癥性腸病中的變化進行了表征。值得注意的是， α-defensins在小腸 LGR5+ 干細胞中表達最多，而不是在 Paneth 細胞中表達，并隨著細胞成熟而下調。常見的上游轉錄因子控制著 AMPs 的表達，闡明了上皮分化過程中 AMPs 的并發變化和空間共表達模式。分析證明了risk genes的細胞焦點與疾病位置易感性的對應關系，identified distinct cell-cell crosstalk and spatial heterogeneity of immune cell homing in different gut segments。總體而言，單細胞分辨率轉錄組的跨時空方法表明，人類腸道的區域環境決定了免疫監視的細胞和分子線索，決定了腸道穩態和疾病。
Introduction
腸道免疫監測對于協調身體與環境之間的營養和免疫至關重要，因為它介導了微生物耐受性和病原體防御。 免疫監視障礙與具有獨特區域易感性的疾病有關，例如炎癥性腸病 (IBD) 和胃腸道腫瘤。
最近的單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 研究為具有區域易感性的疾病期間粘液屏障和免疫細胞的功能障礙提供了新的見解。 然而，腸道微生物免疫監視的區域模式以及支持監視的細胞、分子和細胞間機制仍不清楚。 此外，需要揭示胎兒發育和疾病期間免疫監視的變化。
粘液層、上皮細胞和免疫細胞構成了人體腸道的分級免疫監視。 在本研究中，旨在整合 scRNA-seq 和空間轉錄組 (ST) 以創建胎兒、健康成人和 IBD 患者的綜合腸細胞圖譜，以確定上皮細胞分化和功能形成的分子機制。 我們的數據通過描繪免疫監視的區域異質性及其在胎兒發育和 IBD 中的變化，揭示了區域環境在腸道疾病過程中的貢獻。
Results
High-resolution cell atlas of the healthy human intestine
總共收集了代表十二指腸、空腸和回腸的 14 個活檢樣本，并將其分離到上皮或固有層中，并基于 10x Chromium 進行了單細胞轉錄組測序，從 53,749 個細胞中生成了高質量的轉錄組。 新生成的profiles與來自健康回腸、結腸和直腸 10,19 的 54 個人類樣本（37,821 個細胞）的已發布數據一致，形成了一個涵蓋上皮、免疫和 stromal compartments的綜合細胞圖譜 。
根據compartment-specific，無監督聚類初步將細胞分為六個x compartments，即上皮細胞、T/先天淋巴細胞 (ILC)、B 細胞、基質細胞、單核吞噬細胞 (MNP) 和肥大細胞區室。 基于迭代聚類，確定了59個具有獨特基因表達和片段分布的子集，其中8個是新定義的。
New intestinal cell subsets and states
M02-LILRB5+ 巨噬細胞 (LILRB5+CCL3L3+MRC1+CD163+) 在小腸 (SI)，以特定的趨化因子和受體（CCL3L3、CCL4L2、CCR1、CX3CR1 和 C5AR1）為特征，并分散在固有層中，如空間轉錄組分析所示。 腸道 LILRB5+ 巨噬細胞能夠通過 CX3CR1-CCL3L3/CCL4L2 軸進行utative self-recruitment，可能分別通過 CX3CR1 和 CD163 感知細菌代謝物并限制炎癥。 M03-CXCL9+ 巨噬細胞 (CXCL9+ CXCL10+) 位于回腸末端和結腸，可能通過 CXCL9/CXCL10-CXCR3 與 cDC1、Th1 樣 Trm 和 DP + Th1 樣細胞相互作用而與腸道炎癥相關。 與 M02 和 M03 相比，M04-CCL18+ (CCL18+) 和 M05-MMP9+ (MMP9+MMP12+PLA2G7+) 巨噬細胞定位于腸道相關淋巴組織 (GALT) 。M05 的傳遞和分化可能受基質金屬蛋白酶 9 和 12的控制。
B05-FCRL4+ 和 B06-CAMP+ 記憶 B 細胞主要位于回腸的 GALT。 B05 中高度表達的趨化因子受體（CCR1、CCR2、CCR6 和 FCGR2A）可能會在炎癥期間增強它們的 homing，而由 CAMP 編碼的 AMP LL-37 可能會導致 B06 表現出抗菌功能。
正如 RGS5、SOD3 和 GPX3 的上調所表明的那樣，一個罕見但獨特的亞群 S06-RGS5+ 內皮細胞呈現出缺氧誘導的內皮細胞凋亡的功能狀態。 SI 填充的 S05-RSPO3+OGN+ 成纖維細胞表達與 S07-RSPO3+OGN- 成纖維細胞相似的腸道穩態支持基因，其先前已在結腸中鑒定。 然而，S05-RSPO3+ 成纖維細胞上調中性粒細胞和 T 細胞homing趨化因子 CXCL2、3、6，同時下調漿細胞募集趨化因子 CCL7。 值得注意的是，S05 比結腸 S07 表達更高的 C3 和 C7。
NK、ILC1、ILC2 和 ILC3 的譜系特異性基因富集在兩個獨立的細胞cluster中，即 NK-ILC1 和 ILC2-3。 ILC2-3 子集共表達 ILC2 相關基因 AREG 和 GFI1，以及 ILC3 標記物 RORC 和 IL22。 重新組合 NK-ILC 的嘗試失敗，以及偽時間分析反映的連續狀態，表明 NK-ILC 區室存在過渡狀態，并通過熒光激活細胞分選 (FACS) 進一步證實。
Fate decision tree of intestinal cells
構建了一個由 543 個激活的調節模塊組成的基因調控網絡 (GRN)。 確定了已知細胞類型的conical transcription factor(TF)，例如用于分泌性腸細胞的 ATOH1 和用于 CD4+ 和 DP 型 3 細胞因子 T 細胞的 RORC，以及新確定的細胞類型的 TF，例如用于 FCRL4+ 記憶 B 細胞和 ZNF7 的 POU2F2 LILRB5+ 巨噬細胞。 層次聚類和差異分析發現了決定細胞亞群分化的調節子開關。 例如，SOX17 和 TAL1 分別控制淋巴管和血管內皮細胞的分化，隨后激活 MSC 以促進 RGS5+ 內皮細胞的生成。 與整個轉錄組相反，regulon activity將腸細胞分為相同但連續的細胞譜系。
Shaping of regional epithelial cell differentiation and molecular characteristics by the microenvironment
基于41個獨特的GRN和命運決策樹，腸的解剖位置深深影響了區域上皮亞群的分化，即SI的GATA4、GATA5和PDX1，以及結腸干細胞的TFCP21、HOXB9和HOXB13， transit-amplifying（ TA) 細胞和未成熟的腸細胞。 然而，不同上皮亞群 GRN 對微環境的敏感性是可變的。 吸收性腸細胞、杯狀細胞和 Paneth/BEST4+ 腸細胞在整個腸道中顯示出顯著的 GRN 異質性，盡管在簇狀細胞和腸內分泌細胞 (EEC) GRN 中并非如此。Bile acid receptors NR1H4 and NR1H3 were highly expressed in small intestinal stem cells, TA cells, and immature enterocytes, and less so in mature goblet cells, enterocytes, and Paneth cells, indicating the involvement of environmental signals in epithelial cell differentiation since bile acids differ regionally。
Consistently，偽時間分析顯示腸細胞、杯狀細胞和 Paneth/BEST4+ 腸細胞的區域異質性高于簇狀細胞和 EEC，在細胞分化過程中增加。根據近端 SI、回腸和結腸直腸的局部環境，腸細胞、杯狀細胞和 Paneth/BEST4+ 腸細胞顯示出明顯的功能富集。富含脂肪的近端 SI 中的腸上皮細胞顯示與脂溶性維生素消化和吸收途徑相關的基因上調，例如維生素 A。與它們在近端 SI 的消化、吸收和代謝途徑中的富集相反，回腸腸上皮細胞富含多種免疫相關過程，與回腸中過多的淋巴結構相一致。值得注意的是，基于各種粘液相關基因（如 SPINK4、CLCA1 和 FCGBP 以及粘液相關基因）的上調，腸細胞在粘液生物合成和分泌中向消化道末端匯聚為杯狀細胞。代謝途徑。遠端腸道中富集的杯狀細胞和杯狀腸細胞可能構成增強的粘液屏障，適應微生物群形狀的環境。
Functional epithelial subset differentiation
接下來，研究了受微環境影響的腸上皮功能亞群。成熟的腸細胞、杯狀細胞和 Paneth/BEST4+ 腸細胞分別重組為 6、4 和 6 個功能亞群，具有泛腸分布但具有極端的區域異質性。以杯狀細胞為例，富含直腸的SET+杯狀細胞亞群為早熟，其特點是RNA剪接活躍、mRNA代謝活躍、生長因子反應活躍。 SELENBP1+ 杯狀細胞主要分布在結腸中，代表更高的損傷或凋亡，這通過細胞對化學應激的反應和活性氧的解毒作用的增強來揭示。 TFF3+和 TFF1+ 杯狀細胞均在粘液形成和微生物防御中起作用。 TFF3+ 杯狀細胞在結腸隱窩底部富集，表達增加水平的粘液相關基因（RNASE1、AGR2、TFF3、CLCA1 和 SPINK1）和微生物防御相關基因（ITLN1 和 WFDC2）。然而，主要位于 SI 隱窩頂部的 TFF1+ 杯狀細胞上調了 TFF1、FCGBP、ZG16 和 LYPD8 的表達水平，這些表達水平與粘液層穩定性和微生物防御有關。值得注意的是，偽時間分析表明 TFF1+ 子集源自 TFF3+ subsets。
Antimicrobial peptide-mediated regional immune surveillance
對 40 種腸道表達 AMP 的分析表明，大多數 AMP 在不同腸道區域的表達模式不同，例如 SI 和 WFDC2 中的 DEFA5/6、REG3A、REG3G、ITLN2、DMBT1、GBP1、LEAP2 和 H2BC6/7/8 、SLPI、LYPD8、CCL28、ADM、DEFB1、PI3、CCL20、CXCL1、CXCL2、H2BC12/21 和大腸 (LI) 中的 RNASE6。 除 H2BC12 外，SI 和 LI 在遠端均顯示出較高的 AMP。 此外，AMPs 表達顯示細胞特異性，即近端 SI EEC 中的 HAMP、回腸 EEC 中的 TAC1 和近端 SI Paneth 細胞中的 NPY。 值得注意的是，區域特異性 AMP 在特定片段的所有上皮細胞中均有表達，但表達水平不同。 總之，區域和細胞類型特異性 AMP 表達模式似乎塑造了微生物群落。
胎兒腸道的進一步 scRNA-seq 譜表明，AMP 的區域異質性出現在出生前的不同時間點，例如 DEFA5 為 12-13 PCW，LYPD8 為 15-16 PCW，WFDC2 為 12-13 PCW，盡管胎兒 AMP 水平低于成人。
The spatial distribution of AMPs along the crypt-villus axis suggested a unique niche of intestinal stem cells
出乎意料的是，DEFA5/6、REG3A/G、ITLN2 和 PRSS2 在小腸，尤其是近端腸中的表達與 LGR5 呈正相關，并在細胞成熟過程中下降，表明干細胞（而不是表達最高水平的 Paneth 細胞） 溶菌酶編碼基因 LYZ) 是某些 AMP 的主要來源，例如防御素。 免疫熒光證實了 DEFA5、PRSS2 和 LGR5 的共表達。 小鼠空腸絨毛的激光捕獲顯微切割和測序 (LCM-seq) 顯示 AMP 在絨毛底部附近富集，這與我們的數據一起表明 AMP 在小腸隱窩 - 絨毛軸的下部富集。 SI 中 AMP 的這種分布模式可能有助于維持腸道干細胞生態位。 相反，正如空間轉錄組學 (ST) 所揭示的，除了 WFDC2 和 ITLN1，大多數結腸直腸 AMP 在隱窩軸的頂部較高。
此外，ST 分析顯示 GALT 中 AMP 的表達有限，其中 CAMP 主要由 CAMP+ 記憶 B 細胞表達，而巨噬細胞產生 HAMP、RNASE6 和 LYZ。 GALT 的關節結構可能解釋了獨特的 AMP 表達，并有助于殺死被微褶樣細胞捕獲的病原體。
Transcription factor regulatory network controls the regional expression of antimicrobial peptides
考慮到上皮分化過程中 AMP 的同時變化，以及空間共表達模式，我們假設存在標準的 AMP 上游調節劑。 為了獲得機制上的見解，我們生成了 SI 和 LI 特異性 AMP 的轉錄因子-靶基因網絡，證實了 AMP 的常見上游 TF 的存在。 有趣的是，SI AMP，即 DEFA5、DEFA6、PRSS2、REG3G、LEAP2 和 REG3A，受膽汁酸受體 NR1H4 和 NR1H3 的調節，這與 AMP 在 NR1H4 和 NR1H3 依賴性腸干細胞中的大量表達一致， TA 細胞和未成熟的腸細胞。 一致地，回腸中最高的膽汁酸濃度可能導致遠端 SI 中 AMP 的表達升高，突出了微環境在先天免疫中的作用。
A shift of AMPs in UC and Crohn’s disease (CD)
在 IBD 患者中已經注意到幾種 AMP 的異常表達。 為了描述 IBD 期間的綜合 AMP 反應，我們分析了來自 UC 患者的結腸、CD 患者的回腸以及健康對照組的非炎癥和炎癥活檢的 scRNA-seq 數據。 UC患者結腸上皮顯示幾乎所有AMPs顯著上調，包括富含SI的AMPs，如DEFA5/6、REG3A和ITLN2，并且水平隨著疾病的進展而升高（健康<非炎癥< 炎癥）。 相比之下，CD 患者回腸上皮的 AMP 改變顯示出不一致的趨勢，表明 AMP 在 UC 和 CD 的發病機制中具有不同的作用。 UC 期間增加的 AMPs 可能是對致病微環境的補償性反應，而即使在 CD 期間內鏡炎癥出現之前抑制 AMPs 可能會加劇病情。
值得注意的是，UC 患者結腸上皮中表達杯狀細胞標志物（MUC2 和 ITLN1）的一組上皮細胞顯示出上調的 SI 特異性 AMP（DEFA5、DEFA6、REG3A 和 ITLN2）。 根據杯狀細胞亞群的功能分析，產生AMP的細胞是位于隱窩底部的TFF3+杯狀細胞（TFF1─LYPD8─）。
Regional heterogeneity of adaptive immune surveillance
ScRNA-seq 數據顯示漿細胞主要分布在近端 SI 和結腸，而濾泡 B 細胞分布在回腸，與 Peyer 斑塊的富集一致。 IGHA1 和 IGHA2 等 IgA 相關基因在結腸漿細胞中的表達明顯高于小腸。 相比之下，IgM 相關基因 IGHM 顯示出相反的模式，表明由 IgM/IgA 類別轉換介導的區域免疫監視。 與免疫球蛋白合成、加工和分泌相關的基因在 SI 和 LI 之間也存在差異
Regional cores and heterogeneity of intestinal compartment/cell crosstalk
基于受體-配體對的細胞-細胞相互作用和網絡表示分析表明，不同compartments中的細胞 - 細胞串擾代表了compartmentalization and de-compartmentalization的共存。 上皮細胞、成纖維細胞和髓細胞compartments（即compartmentalization）內顯示更強烈的交流強度，而 T/ILC、B、神經膠質和內皮細胞被de-compartmentalization。 在compartment/細胞串擾的強度中觀察到顯著的區域異質性（回腸 > 近端 SI > 結腸），表明 CD 以回腸為主，其特征是透壁炎癥、穿透性和纖維化狹窄，與 UC 的黏膜局限性。 SI 中室間串擾的核心由單核細胞、巨噬細胞和基質細胞組成，而 LI 由 MNP 和上皮細胞組成。
Molecular basis of intestinal immune cell homing
趨化因子-受體對構成了免疫細胞競爭homing的分子基礎。 結果證明，同一譜系表現出免疫細胞募集的區域特異性能力，從而導致免疫細胞的空間分布。 例如，上皮中 CXCL1、2 和 3 的增加，以及它們向遠端消化道的成纖維細胞減少，表明中性粒細胞可能在 SI 中固有層成纖維細胞附近富集，但被募集到結腸上皮。
確定了區域特異性趨化因子，例如 SI 上皮中已知的 CCL25 和新發現的 SI T 細胞、NK-ILC1 和 MNP 中的 CCL3L3 和 CCL4L2。 預測了新的相互作用，即 GPR42-CCL4L2 介導的肥大細胞-T 細胞/NK-ILC1 相互作用，CX3CR1 介導的 LILRB5+ 巨噬細胞和 CXCL9+ 巨噬細胞歸巢至表達 CX3CL1 的成纖維細胞和內皮細胞，以及 CCR4 介導的 Treg homing至 CCL22 表達 LAMP3+ DC。 此外，除了幼稚T細胞、濾泡B細胞和肥大細胞外，所有免疫細胞譜系都存在自我招募的正反饋。
Mapping cellular and regional foci of intestinal diseases
全基因組關聯研究 (GWAS) 確定了腸道疾病的風險等位基因。我們確定了所有 59 個細胞亞群中 9 種疾病的 85 個風險基因的表達，以確定疾病的細胞起源，例如 ILC2-ILC3 中的 CD 風險基因 IL23R 和 MMP9+ 中的食物過敏 (FA) 風險基因 MMP12 和 STXBP6分別是巨噬細胞和肥大細胞。基因集富集分析表明在特定譜系中富集了疾病風險基因。例如，CD、UC、內部結核病和乳糜瀉風險基因在MNPs中富集，FA基因在肥大細胞、內皮細胞和濾泡B細胞中富集。與免疫細胞紊亂相關的多種疾病表明異常免疫監視在腸道疾病的發生中起著至關重要的作用。我們進一步研究了五種疾病的細胞和區域易感性，其風險基因在免疫區室中富集，與流行病學特征一致。根據區域趨勢，CD風險基因SNX20、CARD9、IL27和PRDM1在回腸CXCL9+巨噬細胞中富集，IL10在回腸FCN1+單核細胞中富集。 TB 風險基因、TAB3、MICB、TAP2 和 C6orf47 富含回腸 S100A8+ 單核細胞。
Discussion
提出了一個跨腸道空間的綜合細胞和空間圖譜，由 59 個細胞亞群組成，其中 8 個是新發現的。 具有獨特基因表達、片段分布和空間定位特征的新亞群與炎癥進展和微生物防御有關。 確定了 ILC 的過渡狀態，這意味著潛在的極化及其對腸道疾病的影響。
該圖譜提供了對環境調節的上皮分化和區域分子和功能特征的新見解。 通過GRN分析表明解剖位置對于區域上皮亞群的分化至關重要。 不同上皮細胞 GRN 對微環境的敏感性似乎是可變的
確定了整個發育和成年期間 AMP 介導的免疫監視的區域和空間異質性，表明 SI 和 LI 之間存在高度可變的 AMP 模式，這可能與塑造 SI 和 LI 的不同微生物群落有關。 確定了 AMP 在不同區域的干細胞生態位維持中的獨特作用。 AMPs 集中在 SI 的隱窩底部，但主要位于結腸隱窩的頂部。 SI和LI AMPs空間分布的這種差異可能符合粘液層的獨特結構，需要進一步研究 。
分析的數據顯示，SI 中的 LGR5+ 干細胞，尤其是近端，表達最高水平的 SI 特異性 AMP，以 DEFA5/6 為代表。這一結果令人驚訝，因為腸上皮衍生的微生物防御機制過去主要歸因于Paneth cells。一項小鼠研究可能將我們數據中的這些 LGR5+ 細胞反映為致力于成熟為分化的分泌細胞的前體。常見的上游 TF 控制 SI 和 LI 中的 AMP，闡明了上皮分化過程中 AMP 的同時變化，以及空間共表達模式。值得注意的是，膽汁酸受體 NR1H3/4 參與調節 SI 特異性 AMP 的表達，強調環境信號參與 AMP 介導的腸道免疫監視，并與胎兒發育過程中逐漸建立的區域 AMP 模式一致，因為大約 17 PCW 是胎兒膽汁分泌開始的關鍵窗口。有趣的是，隱窩底部的杯狀亞群導致了 UC 期間防御素的上調，而不是之前認為的Paneth cells metaplasia。
此外，風險基因的細胞焦點與疾病位置易感性的對應關系，以及不同腸道段中不同的細胞間串擾和免疫細胞的空間異質性，為腸道疾病中區域環境決定的免疫監視提供了新的見解。 總的來說，我們的數據揭示了人類腸道的區域環境決定了免疫監視的分子線索，決定了腸道穩態和疾病，這可能會為人類醫學帶來借鑒。
Methods（關注一些重點方法）
Graph clustering and partitioning cells into distinct compartments（scanpy的分析）
Estimation of cell proportions
Transcription factor module analysis（pySCENIC）
Fate decision tree construction (regulon-based)(scanpy)
Trajectory analysis(PAGA)
Cell-cell interaction and network representation analysis
生活很好，有你更好
