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1．準備序列文件
準備fasta格式序列文件（fasta格式：大于號>后緊跟序列名，換行后是序列。舉例如下）。每條序列可以單獨為一個文件，也可以把所有序列放在同一文件內。
核酸序列：
>sequence1_name
CCTGGCTCAGGATGAACGCT
氨基酸序列：
>sequence2_name
MQSPINSFKKALAEGRTQIGF
2．多序列比對
打開MEGA5，點擊Align，選擇Edit/BuildAlignment，選擇Createa new alignment，點擊OK。
要選擇序列類型，核酸（DNA）或氨基酸（Protein）。
選擇之后，在彈出的窗口中直接Ctrl + V粘貼序列（如果所有序列在同一個文件中，即可全選序列，復制）。也可以：點擊Edit，選擇Insert Sequence From File，選擇序列文件（可多選）。
序列文件加載之后，呈藍色背景（為選中狀態）。點擊按鈕
選擇Align DNA（如果是氨基酸序列，則會出現Align Protein）。彈出的窗口中設置比對參數，一般都是采用默認參數即可。點擊OK，開始多序列比對。
比對完成后，呈現以下狀態。
這時需要截齊兩端含有---的序列：選中含有---的序列，按鍵Delete刪除（注意：兩端都需要截齊）。截齊之后，保存文件為：filename.mas
3． 構建系統進化樹
多序列比對窗口，點擊Data，選擇Phylogenetic Analysis，彈出窗口詢問：所用序列是否編碼蛋白質，根據實際情況選擇Yes或No。此時，多序列比對文件就激活了，可以返回MEGA 5主界面建樹了。
MEGA 5主界面。點擊Phylogeny，選擇Construct/Test Neighbor-Joining Tree…彈出的對話框詢問：是否使用當前激活的數據，選擇Yes。這時彈出建樹參數設置對話框，更改No. of Bootstrap Replications為1000，其他參數默認即可，點擊Compute。
這里解釋一下，Construct/Test Maximum Likelihood Tree…（ML）或Construct/Test Neighbor-Joining Tree…（NJ）或Construct/Test Minimum-Evolution Tree…（ME）為三種不同的建樹方法，NJ方法最常用。
建樹完成，效果如下所示。注意，要點擊Bootstrap consensus tree查看樹形。保存文件為filename.mts(可以用MEGA 5打開)。
4． 后期修改
為了美觀，也是為了滿足發表文章的要求，需要對進化樹進行樹形、字體、字號的修改。點擊View，選擇Options。彈出窗口中，在Tree標簽中可以修改枝與枝之間的距離（Taxon Separation）、枝長（BranchLength）和樹寬（Tree Width），調整至美觀即可。Branch標簽中，可以選擇勾選“Hide values lower than %”，一般隱藏50%以下的數值。其他的參數可以自行研究，一般默認即可。
文字字體、字號的修改。
方法1：點擊Image，選擇Saveas PDF file，保存至filename.pdf。打開軟件AdobeIllustrator CS6，文件---打開---選擇剛剛保存的PDF文件。修改好之后，文件---導出---可以導出很多種類型的文件。一般選擇保存成TIFF（.tif）文件，顏色模式選擇RGB，勾選LZW壓縮，其他默認。
方法2：點擊Image，選擇Copyto Clipboard。粘貼到Word中，右擊進化樹圖片，編輯圖片。即可更改字體字號。修改好可以了。或者進一步導出圖片格式：先將該word文件打印生成PDF文件，再用Adobe Illustrator CS6或Adobe Photoshop CS6導出圖片格式。
