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今天我們繼續分享單細胞空間聯合分析的內容，分享的文章在Spatial transcriptomics of dorsal root ganglia identifies molecular signatures of human nociceptors，2022年2月發表于Science Translational Medicine，IF 18分，值得學習。
Abstract
傷害感受器是專門的感覺神經元，可檢測破壞性或潛在破壞性刺激，存在于背根神經節 (DRG) 和三叉神經節中。這些神經元對于最終產生疼痛感知的神經元信號的產生至關重要。傷害感受器也是治療急性和慢性疼痛的主要目標。小鼠傷害感受器上的單細胞轉錄組學改變了我們對疼痛機制的理解。y研究試圖為人類傷害感受器生成等效信息，目的是識別傷害感受器的轉錄組特征，識別物種差異和潛在的藥物靶點(藥物靶點，嗯，網臨床方向靠攏)。使用空間轉錄組學對來自八個器官供體的單個 DRG 神經元的轉錄組進行分子表征。鑒定了 12 個人類感覺神經metacluster，其中 5 個是 C 傷害感受器，以及 1 C 低閾值機械感受器 (LTMR)、1 個 Aβ 傷害感受器、2 Aδ、2 個 Aβ 和 1 個本體感受器亞型。通過關注離子通道、G 蛋白偶聯受體 (GPCR) 和其他藥理學靶點的表達譜，提供了人類 DRG 中潛在藥物靶點的豐富圖譜，并與小鼠感覺神經元轉錄組進行了直接比較。還將人類 DRG 神經元亞型與非人類靈長類動物進行了比較，顯示出許多細胞類型中基因表達的保守模式，但特定傷害感受器亞群之間存在差異。最后，確定了人類 DRG 亞群轉錄組的性別差異，包括女性瘙癢原受體豐富的傷害感受器中降鈣素相關多肽 α (CALCA) 表達的顯著增加。這種對人類傷害感受器的全面空間表征可能會為開發更好的急性和慢性疼痛疾病治療方法打開大門。
INTRODUCTION
疼痛是一個重大的醫學問題，幾千年來一直使用可以追溯到天然產物的藥物治療。盡管最近批準了一些基于機制的新療法來治療疼痛，但這些療法是基于臨床研究中的生化觀察而開發的，例如與偏頭痛相關的降鈣素基因相關肽 (CGRP)。將主要在嚙齒動物中完成的外周疼痛機制的臨床前工作轉化為有效的疼痛治療方法一直令人不滿意。這種未能轉化的一個潛在解釋是，小鼠和人類之間存在傷害感受器分子表型的重要物種差異，這一觀點得到了bulk RNA 測序 (RNA-seq) 實驗和其他證據的部分支持。傷害感受器是疼痛通路中的第一個神經元，并表達多種受體，使它們能夠對來自環境、組織中的局部細胞以及可能參與炎癥或其他過程的浸潤免疫細胞的刺激作出反應。這些神經元在急性和慢性疼痛狀態下都增加了它們的興奮性，并且其興奮性表型的變化，例如自發活動的產生，與神經性疼痛等慢性疼痛狀態直接相關。因此，傷害感受器是急性和慢性疼痛藥物的關鍵靶細胞。在這里描述的工作中，創建了背根神經節 (DRG) 中人類感覺神經元的高分辨率地圖，包括傷害感受器，目的是加速發現和/或驗證可以操縱的高質量藥物靶點以改善疼痛治療。
DRG 神經元的單細胞測序描繪了小鼠體感神經元亞型的分子結構，闡明了它們的發育轉錄路徑，并描述了這些神經元如何改變表型以響應損傷。然而，由于缺乏人類感覺神經元的全面轉錄組圖譜，尚不清楚如何將這些信息應用于人類。大多數當代單細胞分析研究都使用核 RNA-seq，因為該技術具有可擴展性、完全商業化且廣泛可用。然而，人類 DRG 神經元是體內最大的神經元之一（直徑 20 至 100 um），并且具有較大的細胞核，這給許多測序平臺帶來了挑戰。感覺神經元也是具有大細胞質體積的有絲分裂后細胞，其中含有高濃度的核外 RNA。將空間分辨率與準確采樣細胞質 RNA 的能力相結合的測序技術可能會更清晰地顯示完整的神經元轉錄組，這在尋找可能具有低表達的藥物靶標時很重要。為了克服這些技術挑戰并填補關于人類感覺神經元轉錄組的知識空白，我們對從器官捐贈者獲得的人類腰椎 DRG 進行了空間測序實驗（10x Genomics Visium 技術，使用 55-um 條形碼點）。確定了一種本體感受器、兩種 Aβ 低閾值機械感受器 (LTMR)、一種 Aβ 傷害感受器、一種 Aδ-LTMR、一種 Aδ 高閾值機械感受器 (HTMR)、一種 C-LTMR 和五種 C-傷害感受器亞型。將我們的發現與小鼠和非人類靈長類動物數據集進行了比較，不僅發現了許多相似之處，而且發現了重要差異，其中許多對疼痛目標識別具有重要意義。由于疼痛機制的性別差異越來越被認可，我們對相同數量的男性和女性樣本進行了研究。預計分析數據將促進我們對人類分子疼痛機制的理解，并為疼痛和瘙癢治療的發展開辟一條新的道路。
RESULTS
Spatial transcriptomics generates near single-neuron resolution
使用 10x Genomics Visium 空間基因表達平臺為單個神經元生成了全細胞轉錄組。該技術使用印在 Visium 載玻片捕獲區域上的 55-um 條形碼點。在交叉鉗夾后 4 小時內從神經死亡器官供體收集的human DRGs 被切片到 Visium 載玻片的捕獲區域，染色和成像。組織透化后，每個切片的 mRNA 與帶條形碼的引物結合，隨后進行文庫制備和 RNA-seq 處理。我們平均獲得了約 52 M 的reads，每個切片平均檢測到約 24,000 個基因，從 16 個組織切片中總共檢測到約 830 M 的reads。由于每個部分都經過染色和成像，因此可以使用 Loupe Browser (10x Genomics) 在每個 DRG 部分中可視化帶條形碼的 mRNA 和相應基因的位置。此外，可以根據它們在組織上的位置來選擇帶條形碼的spot。為了產生接近單神經元的分辨率，選擇了在所有部分中與單個神經元重疊的所有條形碼，并對其進行處理以進行下游分析。從每個供體的兩個組織切片（共 16 個切片）中，確定了 4356 個與單個神經元重疊的條形碼（神經元條形碼，也包含來自其他周圍細胞的一些信號）和 12118 個直接圍繞神經元的條形碼（周圍的條形碼）。其余 20,725 個條形碼點被歸類為其他條形碼。與多個神經元重疊的條形碼被排除在外。我們優化了組織通透性以增強神經元 RNA 在載玻片上的洗脫，develop neuronally enriched libraries。我們在神經元條形碼中檢測到更多數量的 RNA 分子和更多數量的獨特基因。此外，神經元條形碼具有與周圍和其他條形碼不同的基因表達譜。
分析中，去除了具有低讀數和低神經元標記 SNAP25 計數的神經元條形碼。 共有 3952 個神經元條形碼按供體 ID 分組，并使用 Seurat 的anchor集成工作流程進行聚類，然后進行基于圖形的聚類。 最初，Seurat 生成了 16 個cluster。 重點介紹了文獻中在這些clusters中豐富的幾種已知神經元標記，以根據其特定的基因富集來表征人類 DRG 神經元的這些子集。 最終選擇了八個clusters進行合并。 這些中的每一個都是具有高度重疊基因表達的相鄰cluster，其中兩個clusters合并為一個。 最終得到了 12 個人類 DRG 神經元的最終clusters。
Defining the transcriptomes of human sensory neuron subtypes
DRG 神經元來源于神經嵴細胞，負責將所有軀體感覺（觸覺、本體感覺、傷害感受和溫度）從身體傳遞到脊髓和腦干。根據細胞體的直徑和傳導速度，這些神經元被分為兩大類——A 纖維和 C 纖維。有髓 Aβ 纖維神經元大多是直徑較大的細胞，它們通過負責檢測無害刺激（尤其是輕觸）的末端器官支配皮膚。本體感受器支配肌肉和其他結構，并負責傳達有關我們四肢在太空中位置的信號。無髓鞘、小直徑 C 纖維神經元對于檢測大多數有害刺激至關重要。 Aβ 神經元不僅有輕度髓鞘，而且比 C 纖維直徑更大，而且對有害范圍內的刺激也有反應。這些類別的感覺神經元在發育和成年期間差異表達特定的神經營養受體。
在 A 纖維組中，確定了人類 DRG 中的六種亞型。The first cluster was classified as proprioceptors (cluster 1) based on the expression of parvalbumin (PVALB), neurotrophic receptor tyrosine kinase 3 (NTRK3), and acid-sensing ion channel subunit 1 (ASIC1) and reduction in neurotrophic receptor tyrosine kinase 2 (NTRK2) . 該cluster還富含鉀電壓門控通道調節劑亞家族 S 成員 1 (KCNS1) 和 Runt 相關轉錄因子 (RUNX) 家族轉錄因子 3 (RUNX3) 的豐富表達，在脊椎動物中發揮進化保守作用抑制 A 纖維本體感受器中的 NTRK2。 Aβ 緩慢適應 (SA) LTMR（cluster 2）innervate hairy and glabrous skin并終止于 Merkel cells 細胞。這些神經元富含 NTRK3 和 PVALB，并顯示出較低的 NTRK2 表達，這種表達模式與小鼠中的 Aβ SA LTMRs 一致。這些神經元還富含受體活性修飾蛋白 1 (RAMP1) 表達，這是 CGRP 受體的受體成分。 The end organs of Aβ rapidly adapting (RA) LTMRs are Meissner and Pacinian corpuscles in glabrous skin and lanceolate endings in hairy skin。 Aβ RA LTMR subgroup（cluster 3 ）同樣通過 NTRK3 的表達和 NTRK2 的低表達來確定。 A-LTMRs 也稱為 D 頭發傳入，在毛囊中以縱向披針形末端終止。 Aδ-LTMRs（cluster 4）的特點是 NTRK2 的高表達。缺乏這種 Ntrk2 陽性神經元subcluster的小鼠對觸摸不太敏感，并且在受傷后對機械刺激無反應。這表明 Aδ 纖維可能參與了機械性異常性疼痛的發展。 Aδ 纖維以前在人類皮膚神經中的特征與其他物種的“下毛”Aδ 神經元相似。一組 A 纖維神經元表達 NTRK3 和鈉電壓門控通道 α 亞基 10 (SCN10A)，這是一種富含傷害感受神經元的電壓門控鈉通道 (VGNaC)。因此，將這個cluster確定為推定的 Aβ 傷害感受器（cluster 5）。 Aβ-纖維對有害刺激有反應，在包括猴子在內的其他物種中也有報道。最近的一項研究表明，人類也有具有傷害感受特性的 Aβ 纖維傷害感受器。最后的 A 纖維clusters（cluster 7 ）具有 NTRK1、Copine 6 (CPNE6) 和 SCN10A 的高表達，這與小鼠和獼猴中的 HTMR 一致。該cluster還表達降鈣素相關多肽 α (CALCA) 和溶血磷脂酸受體 3 (LPAR3)。
還確定了五種 C 纖維傷害感受器亞型和一個putative C-LTMR cluster。瞬時受體電位陽離子通道亞家族 M 成員 8 (TRPM8)，一種已知的薄荷醇和冷敏感通道，標記為冷傷害感受器（cluster 6 ）。該cluster表達 SCN10A 但幾乎沒有瞬時受體電位陽離子通道亞家族 V 成員 1 (TRPV1)，這是與其他人類傷害感受器cluster相比的獨特特征。腦啡肽原 (PENK) 是一種內源性阿片類藥物和幾種腦啡肽的前體，在另一個 C 傷害感受器cluster（cluster 8）中富集。該cluster還獨特地表達肽遞質基因尿皮質素 (UCN)，并富含前列腺素 E2 (PGE2) 受體 PTGER3，編碼前列腺素 E 受體 3 (EP3)，該受體在 PGE2 受體中不同，在激動劑結合后產生鎮痛作用。另一組 C 纖維通過瞬時受體電位陽離子通道亞科 A 成員 1 TRPA1 表達（cluster 9）來區分。該cluster還顯示出速激肽前體 1 (TAC1)（編碼 P 物質）和 CALCA 的非常高的表達，盡管這些神經肽在所有傷害感受器cluster中廣泛表達。神經肽表達的這種差異是人類和嚙齒動物感覺神經元之間的重要區別，可能表明人類中不存在感覺神經元的肽能和非肽能subcluster。最近的組織學工作進一步支持了這一觀點，表明肽能標記物 CGRP（基因：CALCA）和非肽能標記物 P2X 嘌呤受體 3（P2X3R；基因：P2RX3）在人類 DRG 神經元的 mRNA 和蛋白質水平上高度共表達。這些神經元還共同表達傷害感受器標記鈉通道 Nav1.8（基因：SCN10A）。 CGRP 和 P2X3R 傳入背角在整個 I 層和 II 層中都存在，支持它們在人類傷害感受器中的高共表達。
膽堿能受體煙堿 α 3 亞基 (CHRNA3) 的特異性表達確定了一組putative “沉默”傷害感受器（cluster 10）。Silent nociceptors 對應于支配關節、內臟和皮膚的 C 纖維 subset，通常被稱為機械不敏感 C 纖維。它們在正常情況下對有害的機械刺激無反應，但在炎癥刺激后變得敏感并變得機械敏感，并且可能在某些疼痛疾病中起關鍵作用。Silent nociceptors cluster表達大量離子通道，包括血清素受體 5-羥色胺受體 3A (HTR3A)；嘌呤能受體 P2X 3、4、6 和 7 (P2RX3、P2RX4、P2RX6 和 P2RX7)；質子受體酸感應離子通道亞基 3 (ASIC3)；和谷氨酸受體，例如谷氨酸離子型受體紅藻氨酸型亞基 2 至 5（GRIK2、GRIK3、GRIK4 和 GRIK5）、谷氨酸離子型受體 δ 型亞基 1 (GRID1)、谷氨酸離子型受體 N-甲基-d-天冬氨酸 (NMDA) 型亞基 1 (GRIN1) 和谷氨酸離子型受體 β-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸型亞基 3 和 4 (GRIA3 和 GRIA4)，這可能是這部分神經元對炎癥介質敏感的基礎。這些神經元還表達 H1 組胺受體基因，即組胺受體 H1 (HRH1)，已知該基因可使這些神經元對機械刺激敏感，并且也是組胺誘導的人類瘙癢的可能途徑。因此，這個 C 纖維子集可能也參與了來自外圍的瘙癢信號的產生。根據利鈉肽 B (NPPB)、GDNF 家族受體 α2 (GFRA2) 和白細胞介素 31 受體 A (IL31RA) 的表達，對一個單獨的富含瘙癢原受體的cluster（cluster 11）進行分類，盡管后兩者在其他人群中也發現了基因。數據還顯示鈉電壓門控通道 α 亞基 11 (SCN11A) 在該亞群中的表達非常高。 Nav1.9 (SCN11A) 功能突變增益可導致先天性對疼痛不敏感或部分痛覺喪失。對小鼠的研究報告稱，這種突變會導致瘙癢表型。攜帶 Nav1.9 突變的人報告有嚴重的瘙癢。與 SCN11A 在瘙癢傷害感受器中富集相關的機制可以解釋這種表型。最終的 C 纖維clusters富含 GFRA2，GFRA2 是小鼠中 C-LTMR 的特征標記，被歸類為推定的 C-LTMR（cluster 12）。該cluster在基因表達方面與富含瘙癢原受體的群體具有高度相似性，但 NPPB 的表達較低，NPPB 是小鼠瘙癢傷害感受器的標志物。
Spatial visualization of neuronal subtypes
腰椎 DRG 神經元亞型在任何分析的組織切片中均未顯示出任何清晰的空間組織。 然而，確實使用 DRG 部分中條形碼位置的可視化來測量與 12 個clusters中的每一個相關的神經元直徑。 這一獨立測量驗證了 Aβ cluster對應于 DRG 中直徑最大的神經元，而 C 傷害感受器cluster是最小的。 A? cluster的大小介于 Aβ 和 C 纖維神經元之間，與所有其他已評估的物種的細胞大小分布一致。
Validation of spatial transcriptome-defined subtypes with RNAscope
空間轉錄組學方法提供了對人類 DRG 中存在的神經元類型的詳細洞察，但存在局限性，例如任何給定條形碼都缺乏純單個神經元轉錄組。之前已經證明，RNAscope 原位雜交技術可以高度靈敏地檢測人類 DRG 中的神經元 mRNA。作為驗證工具，對人類 DRG 組織切片進行了 RNAscope 實驗，檢測了幾種在特定神經元cluster中顯示出高豐度的 mRNA：PR/SET 域 12 (PRDM12)、NPPB、生長抑素 (SST)、NTRK1-3、PVALB、LPAR3、 PENK、TRPM8、GFRA2、MAS 相關 GPR 家族成員 X1 (MRGPRX1) 和酪氨酸羥化酶 (TH)。評估了它們與富含傷害感受器的基因 SCN10A、TRPV1 和 CALCA 或其他clusters特異性標記的共表達。傷害感受器群體（SCN10A+、TRPV1+ 或 CALCA+）占所有人類感覺神經元的約 60% 至 70%，并且直徑很小（平均 = 54 um）。PRDM12，一種對人類疼痛感知至關重要的基因，在也共表達 CALCA 的約 74% 的背根神經節神經元中表達。在 Visium 數據的所有神經元cluster和周圍/其他條形碼中檢測到 CALCA mRNA，可能是因為 CALCA mRNA 定位于軸突，解釋了其廣泛檢測。較小的傷害感受器細分，例如假定的沉默和瘙癢原受體豐富的傷害感受器群體（NPPB+ 或 SST+），占也共表達 SCN10A 的群體的約 30%。 NTRK1 在傷害感受器cluster中最為豐富，在 68% 的神經元群體中發現并與 SCN10A 共定位。 NTRK2 在 A? LTMR cluster 中富集，這是一個耗盡 SCN10A 的cluster，在中等大小的神經元中檢測到，與 SCN10A 幾乎沒有共表達。本體感受器 Aβ-LTMR 和 Aβ 傷害感受器標記 NTRK3 存在于較大尺寸的神經元中，與 SCN10A 的共表達略高于 NTRK2，這很可能是由于其存在于 SCN10A+ Aβ 傷害感受器cluster中。在 Visium 數據集中，LPAR3 在 A? HTMR 和 Aβ 傷害感受器cluster中富集，但在其他傷害感受器clusters中也低表達，所有這些clusters都表達 TRPV1。同樣，LPAR3 在 80% 的感覺神經元中表達，其中大部分是 TRPV1 陽性的。 PVALB 在本體感受器和 Aβ SA LTMR clusters中高度富集，在約 45% 的感覺神經元中發現，其中一半是 TRPV1 陰性的。在約 50% 的感覺神經元中發現了冷傷害感受器cluster標記 TRPM8，而在約 35% 的感覺神經元中發現了 whereas PENK, which was enriched in a different cluster。與 Visium 類似，這兩個基因使用 RNAscope 確實顯示出一些重疊（21.2%），但也在不同的population中檢測到
在putative C-LTMR cluster中表達的 GFRA2 在約 33% 的小型人類感覺神經元和高度共表達的 MRGPRX1 中發現。 MRGPRX1 僅在少數條碼中檢測到，均在 C-LTMR cluster中； 然而，使用 RNAscope 檢測到更多的 MRGPRX1+ 神經元，其中許多對 GFRA2 呈陽性。 TH 是 C-LTMR 的小鼠標記，使用 Visium 和 RNAscope 在human DRG 中幾乎沒有表達。 為了進一步評估該cluster，評估了 GFRA2 與 NPPB 組合的表達，因為我們將該cluster分類為潛在的 C-LTMR population，因為它的 GFRA2 表達和 NPPB 的消耗。 觀察到對 GFRA2 和 NPPB 呈陽性反應的神經元 (~27.3%) 和少量表達 GFRA2 的神經元對 NPPB 呈陰性反應 (7.4%)。 這個 GFRA2 陽性、NPPB 陰性的population可能代表了 C-LTMR cluster 12 。
之前報道過 TRPV1 mRNA 在人類傷害感受器中的表達比在小鼠中更廣泛，并且在所有傷害感受器cluster中都檢測到了 TRPV1，除了輕微表達的cold nociceptors。使用 SCN10A 作為傷害感受器標記，再次觀察到在大多數傷害感受器中發現了 TRPV1。接下來確定這些神經元是否對 TRPV1 配體辣椒素有功能反應。辣椒素的應用使所有小型、分離的人類 DRG 神經元去極化，并導致 75% 的動作電位放電。得出結論，RNAscope、空間測序和功能分析支持 TRPV1 在人類傷害感受器中的廣泛表達。作為最終驗證，之前發表的 RNAscope 研究結果證實了 Visium 測序提出的神經元亞群。例如，之前提出 KCNS1 作為人類 Aβ 神經元的標記，因為它在 CALCA 和 P2RX3 呈陰性的大型神經元中表達。使用空間轉錄組學方法，KCNS1 was also enriched in Aβ clusters。
Sex differences in human sensory neurons
雄性和雌性感覺神經元之間的分子差異已在嚙齒動物的特定群體細胞測序實驗中得到報道，并從人類 DRG 的bulk RNA-seq 中推斷出來，但我們對人類 DRG 中神經元基因表達的性別差異的了解有限。根據我們的結果，很明顯，男性和女性具有相同的 DRG 神經元亞型，因為來自兩性的神經元條形碼在所有cluster中都清楚地顯現。然后，在整個神經元細胞和每個特定cluster內尋找性別差異。使用空間測序方法，神經元條形碼包括來自周圍細胞的 mRNA。為了克服對其他細胞類型貢獻的一般性別差異的檢測，對周圍的條形碼（整體周圍的條形碼和特定于每個神經元cluster）進行了統計測試。如果倍數變化 (FC) ≥ 1.33 且調整后的 P < 0.05，則認為基因存在差異表達 (DE)。如果基因在各自的周圍條形碼中不是 DE，認為基因在神經元中是 DE。與在神經元population中性別差異很小的小鼠中的發現相似，在按性別匯集的神經元條形碼中僅鑒定了 44 個具有性別差異表達的基因。然而，這種方法將轉錄組不同神經元的表達數據匯集在一起，創造出主要是不同細胞表型產物的變異。為了克服這個問題，研究了每個神經元亞型中基因表達的潛在性別差異。在這里，發現了更多富含神經元的 DE 基因。富含瘙癢原受體的population具有最多的 DE 基因，這表明男性和女性之間瘙癢機制存在潛在的分子差異。使用 GO 富集分析資源 PANTHER 對所有神經元亞群中的 DE 基因進行了基因集富集分析。沒有在本體感受器、A? LTMR、冷傷害感受器、A? HTMR、PENK+ 傷害感受器、TRPA1+ 傷害感受器、putative 沉默傷害感受器或 C-LTMR 中發現任何 GO terms。我們確定了 GO terms表示富含瘙癢原受體的亞型，84 個用于 Aβ SA LTMR，6 個用于 Aβ RA LTMR。對人類傷害感受器的潛在性別差異特別感興趣，因此專注于富含瘙癢原受體的cluster。在該cluster中的一個主要發現是 CALCA 的更高表達，它編碼 CGRP 蛋白，在富含女性瘙癢原受體的神經元中發現。這一發現在檢查男性和女性器官供體的 NPPB 陽性神經元中 CALCA 表達的 RNAscope 實驗中得到驗證。
Similarities and differences between human and mouse DRG neurons with a focus on pharmacological targets
接下來，檢查了基因家族中單個基因的表達，例如離子通道、G 蛋白偶聯受體 (GPCR) 和酪氨酸受體激酶，它們參與傷害感受器傳遞傷害感受信號，被認為是現有或潛在的藥物。 對來自人類 DRG 的空間轉錄組數據集和來自 mousebrain.org 的 DRG 的小鼠單神經元數據進行了比較。 大多數臨床前研究都是在嚙齒動物（特別是小鼠）中進行的，因此下面的比較表達圖可用于直接評估小鼠和人類之間感覺神經元基因表達譜的異同。
VGNaCs 是神經元攜帶動作電位能力的基礎，感覺神經元表達這些基因的獨特子集。我們觀察到 VGNaC 基因在人和小鼠中具有非常相似的表達模式，這表明編碼通道成孔單元的 α 亞基的表達是保守的。該家族中的一個例外是鈉電壓門控通道 β 亞基 4 (SCN4B) 基因，它編碼 VGNaC 的 β4 亞基。這個 β 亞基對于作為興奮性關鍵貢獻者的復蘇電流至關重要。在小鼠中，Scn4b 主要存在于 A 纖維神經元中，與之前的研究一致，但在人類中，SCN4B mRNA 分布在所有感覺神經元類型中。因為 β 4 亞基通過 Nav1.8 通道調節再生電流，并且這兩個基因在人類傷害感受器中的共表達程度更高，這可能有助于增強這些細胞中的再生 Nav1.8 電流，這一假設可以在未來的實驗中進行檢驗。
GPCR 是哺乳動物基因組中最大的受體家族，在從炎癥檢測到細胞粘附的傷害感受器中具有多種作用。這些受體也是治療發展的重要目標。比較了人類 DRG 中表達最高的 50 個 GPCR 與其在小鼠中的同源物的表達和分布。盡管一些 GPCR 顯示出一致的表達模式，但許多 GPCR 存在分歧，表明該受體家族在物種間的表達存在重要差異。兩個顯著差異是 PTGER3 和 LPAR3 基因。 PTGER3 在人類的 PENK+ 傷害感受器群體中富集，并且也由其他幾種傷害感受器亞型表達，而它僅限于小鼠的非肽能神經元子集。鑒于這種前列腺素受體作為鎮痛靶點的潛力，這對于 EP3 激動劑的治療目的可能很重要。 LPAR3 是溶血磷脂酸的受體，與神經性疼痛有關。這種 GPCR 在人類的傷害感受器亞型中廣泛表達，但再次僅限于小鼠的非肽能傷害感受器。代謝型谷氨酸受體家族 (GRM) 的受體在物種間也表現出不同的表達，這與之前的觀察結果一致，即在人類 DRG 中未檢測到 I 組 GRM 家族基因。一些 GPCR 確實表現出強烈的表達保守性，例如，γ-氨基丁酸 (GABA) B 型受體亞基 2 (GABBR2)，編碼 GABAB 受體復合物的一個亞基，這可能是表達最高的 Gαi 偶聯受體在人和小鼠的感覺神經元中。
白細胞介素 (ILs) 及其受體在神經元亞群中的表達特征可以揭示它們的配體如何與不同物種的不同感覺神經元群相互作用。 例如，IL31RA 在人類 DRG 神經元中的表達比在該基因僅限于瘙癢傷害感受器的小鼠中更廣泛地表達，如先前使用原位雜交所示。 抗炎 IL 受體、IL-4 受體 (IL4R)、IL-10 受體亞基 α (IL10RA) 和 IL-13 受體亞基 α1 (IL13RA1) 在人類感覺神經元亞型中的表達比在小鼠中更廣泛，其中 Il4r 是 沒有檢測到。 其他基因如 IL-6 細胞因子家族信號轉導 (IL6ST) 在人和小鼠中表現出保守表達。
檢查了人類和小鼠神經元亞型中其他基因家族的表達，包括：ASICs、anoctamins、水通道蛋白、鈣通道、氯離子通道、膽堿能受體、離子型 GABA 受體、間隙連接/連接蛋白、離子型谷氨酸受體、甘氨酸受體、神經肽基因、 鉀通道、離子型嘌呤受體、瞬時受體電位通道和參與神經元分化的轉錄因子。 我們還研究了編碼蛋白質的基因表達，這些蛋白質是未充分研究的可成藥基因組的一部分。 我們在人類 DRG 神經元亞型中檢測到 56 個未充分研究的 GPCR、49 個未充分研究的離子通道和 133 種激酶。 最后，創建了具有最低歸一化熵的基因的表達圖，代表在神經元亞型中表達差異最大的基因.
Comparison of human and nonhuman primate sensory neuron subtypes
接下來，我們利用最近發表的來自非人類靈長類 DRG 的單細胞數據集來比較人類和獼猴之間的神經元亞型。
DISCUSSION
工作表明，空間轉錄組學可用于產生接近單神經元的分辨率，以定義人類 DRG 中神經元亞型的分子譜。 我們的研究結果不僅證明了小鼠和人類之間的許多相似之處，而且還表明了它們之間的實質性差異，其中大多數單傷害感受器轉錄組工作已經完成。 其中一些差異可以通過與測序方法相關的技術問題來解釋； 然而，我們展示了獼猴和人類之間更一致的相似性，其中還應用了不同的測序技術，這使得這種可能性不太可能。
我們實驗的一個重要結果是現在能夠以單神經元分辨率直接評估跨物種的目標表達。 我們列出了小鼠和人類 DRGs 中大多數藥理學相關靶點的這些表達譜。 This expression map can allow investigators to initiate DRG-focused target identification efforts with human neuronal transcriptome insight and then make data-driven choices about model species and testing paradigms that best fit the chosen development pipeline.
小鼠和人類感覺神經元之間進化差異最大的一個領域是神經肽、TRPV1 和 NTRK1 表達。 這與之前的原位雜交工作一致。 在小鼠和大鼠中，這些基因在發育早期受到所有傷害感受器的表達調節，然后在出生后靶神經支配后在特定人群中沉默。 與嚙齒動物相比，大多數人類傷害感受器共享這些基因的表達，這表明在其他物種（尤其是小鼠）中發現的許多肽能和非肽能傷害感受器的標記混合在一起。 這表明肽能和非肽能命名法不太可能用于描述人類傷害感受器。 Our findings suggest that development programs that silence TPRV1 and NTRK1 expression in subgroups of nociceptive sensory neurons are not engaged in humans.
我們發現，在富含瘙癢原受體的人群中，受體和神經肽表達存在重要差異，許多已在小鼠中鑒定的標志物更廣泛地表達，特別是在沉默的傷害感受器和推定的 C-LTMR 亞型中。這與先前的研究一致，這些研究顯示了瘙癢原受體基因（如 IL-31 受體）的表達存在物種差異。這也與最近一項比較獼猴和人類 DRG 表達瘙癢原受體 [MAS 相關 GPR 家族成員 D (MRGRPD) 和 MRGPRX1 與 TRPV1 共表達] 的研究一致。這與小鼠實驗形成對比，在小鼠實驗中，Mrgprd 由沒有 Trpv1 的神經元子集表達。 Klein 及其同事還證明，與 MRGPRD 或 MRGPRX1 激動劑相比，組胺在人類志愿者中產生更大面積的耀斑和風團。這一發現可以通過在人類 DRG 中表達 HRH1（H1 組胺受體）的神經元群體的擴張來解釋。我們使用 Visium 和 RNAscope 都沒有發現人類 DRG 中大多數已知的 C-LTMR 標記的表達，例如 TH。這還包括缺乏最近在獼猴核測序研究中發現的標記，這使得在我們的研究中難以識別這一population。例外的是 GFRA2+ 表達，它標記了跨物種的 C-LTMR，從而能夠推定識別人類 DRG 中的 C-LTMR。該亞群通過 RNAscope (GFRA2+/NPPB-) 進行了驗證。
Our spatial transcriptomic characterization of human DRG neuronal subtypes should facilitate discoveries in the pain and sensory neuroscience field. One advance is the identification of sets of markers that can be used to molecularly phenotype subtypes of sensory neurons that can be sampled through skin biopsies and other methods from neuropathy patients. Although there are clear indications of pathology in sensory neurons indicated from clinical skin biopsy studies, these are almost always grouped into small and large fiber neuropathies, but further distinctions are not made. Our work enables greater mechanistic insight from routine clinical tests. The finding that neuronal transcriptomes in the DRG are stable unless frank axonal injury has occurred suggests that our dataset can be used for this purpose almost immediately. Our dataset can also be used to mine for pharmacological targets that can be used to specifically manipulate the excitability of different subsets of nociceptors. This offers the possibility for the development of pain targets that are identified based entirely on human transcriptomic data. Our dataset contains both male and female samples. We highlight sex differences (for example, greater CGRP expression in the pruritogen receptor–enriched population in females) that may be important considerations for therapeutic development. Last, this dataset can be a foundation to more thoroughly vet targets that have been found in studies of peripheral nerves in animal pain models. Our findings might make it possible for conservation of gene expression in human nociceptors to be a first step in derisking pain targets for future drug development.
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