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數據矯正前.png

可以看到，腫瘤樣品的表達量整體就比正常對照樣品的表達量高出一大截，這樣的數據進行后續分析，就會出現大量的上調基因。

因為我一直強調，做表達矩陣分析一定要有三張圖，見：你確定你的差異基因找對了嗎？ ，所以就讓粉絲繼續摸索，其中PCA如下：

做表達矩陣分析一定要有三張圖.png

第一個策略是直接normalizeBetweenArrays處理，然后走差異分析。

第二是先去除批次效應，然后走差異分析。

建議你比較一下，這兩個差異分析的區別。
然后粉絲的行動也很迅速，兩三天就回復了郵件，給出了兩個摸索結果：

方法一：limma 包的normalizeBetweenArrays.png

可以看到，直接normalizeBetweenArrays處理其實就是一個quantile的normalization而已，大家可以去看quantile normalization到底對數據做了什么 - 簡書，了解一下。

從韋恩圖可以看到，沒有進行normalizeBetweenArrays處理之前呢，上調基因真的是超級多啊！經過了normalizeBetweenArrays處理之后呢，其中616個上調基因變成了沒有顯著性改變的基因，然后637個居然由上調基因變成了下調基因，當然了，也有341個基因維持原來的上調屬性。

是不是很可怕！！！

方法二：limma 包的removeBatchEffect.png

但是，如果是bulk轉錄組測序，或者表達量芯片，就基本上不可能做到區分具有生物學差異的兩個樣品的批次效應了。雖然說我在《生信技能樹》寫過不少相關教程，比如：多種批次效應去除的方法比較，但那樣的去除是針對生物學差異與批次效應交叉的情況來去除。比如：

• 第一個批次：2個處理，2個對照樣品
• 第二個批次：3個處理，3個對照樣品

這個時候，就可以使用 limma 的 removeBatchEffect 函數或者 sva 的 ComBat 函數，把批次效應去除掉，然后保留生物學差異供后續的差異分析。

但是如果你的實驗設計是：

• 第一個批次：3個處理樣品
• 第二個批次：3個對照樣品

那我就只能奉勸你，對這個數據集說拜拜了！

normalizeBetweenArrays

rt=read.table("lncRNA.txt",sep="\t",header=T,check.names=F)
#重復基因取均值，去重復
rt=as.matrix(rt)
rownames(rt)=rt[,1]
exp=rt[,2:ncol(rt)]
dimnames=list(rownames(exp),colnames(exp))
rt=matrix(as.numeric(as.matrix(exp)),nrow=nrow(exp),dimnames=dimnames)
rt=avereps(rt)
rt=rt[rowMeans(rt)>0,]
#1個數據集批內矯正
rt=normalizeBetweenArrays(as.matrix(rt))
boxplot(rt)

removeBatchEffect

rt1=read.table("lncRNA1.txt",sep="\t",header=T,check.names=F)
rt2=read.table("lncRNA2.txt",sep="\t",header=T,check.names=F)
rt1=as.matrix(rt1)
rt2=as.matrix(rt2)
rt3<-merge(rt1,rt2)
rownames(rt3)=rt3[,1]
exp=rt3[,2:ncol(rt3)]
dimnames=list(rownames(exp),colnames(exp))
rt3=matrix(as.numeric(as.matrix(exp)),nrow=nrow(exp),dimnames=dimnames)
#查看未作批次矯正前的表達圖
boxplot(rt3)
#多個數據集批次矯正
batch <- c(rep('con',182),rep('treat',32))
group_list <- c(rep('tumor',6),rep('normal',6),rep(c('tumor', 'normal'),each=3))
design=model.matrix(~group_list)
rt=removeBatchEffect(rt3,batch = batch,design = design)
boxplot(rt)
write.table(rt,file="rt.xls",sep="\t",quote=F)