劉小澤寫于2020.5.29
這篇文章做了一件事，就是幫助我們區分不同的批次矯正方法，然后比較了一下優劣
文章題目：Flexible comparison of batch correction methods for single-cell RNA-seq using BatchBench
文章在：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.22.111211v2
上傳時間是：2020.05.22
BatchBench ：https://github.com/cellgeni/batchbench
BatchBench is a Nextflow workflow for running the following scRNA-Seq data batch effect correction methods:
- mnnCorrect
- limma
- ComBat
- Seurat 3
- Scanorama
- Harmony
- FastMNN
- BBKNN
前言
首先為什么要進行批次矯正？
單細胞分析經常會整合一些公共數據，不同的實驗時間、文庫制備、測序方案，都會產生一些技術誤差，如果太多，可能會干擾真實的生物信號。因此來自這些非生物因素的干擾就稱作批次效應
作者將8種常用的批次矯正方法分為3類：
- mnnCorrect、limma、ComBat、Seurat 3、Scanorama：產生一個整合、矯正后的表達矩陣
- Harmony、FastMNN：不是直接操作原始表達矩陣，而是對降維后的結果操作（they operate on a low-dimensional embedding of the original expression matrices），因此如果下游分析如果要用到原始表達矩陣的話，這類方法就會受限
- BBKNN：基于表達矩陣構建k-nearest neighbor graph（KNN），只能進行后續基于細胞的分析（如聚類、分群可視化），不能進行基于基因的分析（如marker基因鑒定、基因網絡）
關于這8種方法：
以及這三類針對什么進行分析以及后續可以做什么，作者也作圖說明：
但真正使用哪種方法，還是要依賴一個評測結果。但傳統的評測只能針對已發表的方法，并且評測缺少一些高質量的數據集（比如盡可能多的包含批次效應的因素）
作者使用BatchBench，針對3種研究深入的數據集，對8種方法進行評測，這個方法的流程是：
三個數據集
Pancreas dataset
Baron (GSE84133)、Muraro (GSE85241)、Segerstolpe (E-MTAB-5061) 分別由inDrop, CEL-Seq2 和 Smart-Seq2產生。過濾細胞：細胞中基因表達量少于200；過濾基因：在少于3個細胞中表達。另外只保留有注釋的細胞類型（去掉了unclassified這類的細胞）
Mouse Cell Atlas datasets
數據來自：https://figshare.com/s/865e694ad06d5857db4b
按照組織進行整合，得到了包含37個器官的數據集，其中選取了18個數據集（它們中包含大于1個批次并且有合理的細胞類型分布）。過濾細胞：基因表達量少于250；過濾基因：在少于50個細胞中表達；過濾細胞類型：細胞數量少于整體1%的類型；過濾批次：細胞數量少于總體5%的批次
Tabula Muris datasets
來自兩個平臺的同一組織的不同數據混合，得到11個器官的數據集。過濾細胞：基因表達量少于1000；過濾基因：在少于50個細胞中表達；過濾細胞類型：細胞數量少于整體1%的類型；過濾批次：細胞數量少于總體5%的批次。結果得到4168個基因，60828個細胞（40,058 from 10X and 20,770 from Smart-Seq2）
直接上結論
Seurat的整體效果最好，它既正確地整合了批次，又沒有丟失不同細胞類型；
Harmony在pancreas和MCA的數據中表現也不錯，但在矯正Tabula Muris數據時失敗；Scanorama 和 fastMNN表現也算良好；
這里使用的熵評估方法，可能不太適用BBKNN，因此它需要額外的評測方法；
另外對于處理大量的細胞數量和批次，Harmony表現優秀，并且計算資源分配合理。除了Harmony和BBKNN，其他方法當遇到上百個批次的處理時（即使一個批次中的細胞數量不多）也會捉襟見肘，因此未來的批次效應處理方法應該向數據可擴展性（scalability）上發展。
如果想使用處理批次效應后的表達矩陣進行下游分析（如鑒定marker基因），這些方法都會遇到問題。因為marker基因并不是保守存在的，任何基于基因的分析（例如 找差異基因或者鑒定marker基因），都是基于基因表達量，而批次矯正方法需要保證不會干擾表達量的變化，這一點也是未來需要改進的。
結果
1 測試批次整合與細胞分群
使用了人類胰腺癌的3個scRNA數據集，原始數據的UMAP結果是：
左邊是三個數據集，右邊是各種細胞類型
但不得不說，兩個圖例使用的顏色太相近，容易引起混淆
可以看到，所有的方法都能將不同數據集的細胞混合起來，而依然可以分離不同的細胞類型
然后為了評估處理（先整合不同批次的細胞，然后分離不同的細胞類型）的效果，提出了計算一個”熵“：normalized Shannon entropy。如果批次方面的熵比較高，說明混合的批次之間更接近，也就是混合效果更好；如果細胞類型方面的熵比較低，說明細胞類型依然可區分
可以看到，不同的方法都保持較低的細胞類型方面的熵，因此它們都能夠保證分離不同類型的細胞；但批次方面的熵差別較大。其中Seurat和Harmony整體表現較好，汽其次是Scanorama和fastMNN；而mnnCorrect, Limma 和 ComBat的表現較差
并且大部分方法對MCA（Mouse Cell Atlas）數據集的整合效果更好
圖例：pancreas data (red), Mouse Cell Atlas (green), and Tabula Muris (blue)
2 當細胞數量或批次數量增加時，批次矯正變得困難
利用 Tabula Muris數據集（總共60,828 cells），取了它的1%、3%、5%、10%、20%、50%作比較
當細胞數量從608（1%）增至60828時，除了Scanorama、Harmony、Seurat，其他方法的批次熵都下降了50%左右。但是Scanorama在混合批次的同時，也混合了細胞類型（可以看到藍色的虛線基本不變，說明細胞類型熵不變，也就是沒有分離細胞類型）
Harmony是唯一一個在增加細胞數量后，批次熵增加的（圖a）。除了Scanorama，其余方法的細胞類型熵都降低，說明細胞數量增多，細胞分群更容易
批次數量增加時，BBKNN, Seurat 和 Harmony表現最穩定（圖d）
在時間方面，mnnCorrect和fastMNN隨細胞數量增長，運行時間也呈現指數增長，mnnCorrect運行最慢。不過時間消耗在大部分軟件中差別不大
在內存方面，所有的方法隨細胞數量增長，內存消耗都呈現指數增長，其中Seurat消耗內存最多。綜上，Seurat, mnnCorrect, ComBat 和 fastMNN是比較消耗資源的，而Harmony, Scanorama 和 BBKNN資源需求最小
a、d：熵的變化；b、e運行時間的變化；c、f：消耗內存的變化
3 批次處理對非監督聚類和marker基因鑒定的影響
使用三種非監督聚類方法：Leiden、Louvain、SC3，然后比較矯正前后的數據聚類結果。這個結果相似性的量化是利用Adjusted Rand Index (ARI)，圖a可以看到：MCA數據集利用不同的方法聚類后結果相似，但組織之間的差異比較大；Tabula Muris數據集也是如此，不過與MCA不同的是，利用SC3方法得到的聚類結果會比Louvain或Leiden結果普遍（11個組織中有7個）有更高的ARI。奇怪的是，對于心臟和乳腺組織，最佳的聚類結果發生在：SC3+非批次矯正的數據。對于pancreas數據，SC3傾向于得到更大的ARI，而且不想MCA數據，Seurat和Harmony的聚類結果與之前的熵分析結果也一致。
對整合后的數據進行marker基因鑒定，只有ComBat和Limma的結果可以找到大部分細胞類型的marker基因，Seurat只能對少部分細胞類型進行鑒定（圖b），但如果檢測單個數據的marker基因與混合矯正后的marker基因之間的一致性，Seurat的一致性更強（圖c）。Seurat的一致性表現是犧牲細胞類型數量得到的
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