基因芯片技術的特點使用寡聚核苷酸探針檢測基因。前一節使用ReadAffy函數讀取CEL文件獲得的數據是探針水平的（probe level），即雜交信號，而芯片數據預處理的目的是將雜交信號轉成表達數據（即表達水平數據，expression level data）。存儲探針水平數據的是AffyBatch類對象，而表達水平數據為ExpressionSet類對象。基因芯片探針水平數據處理的R軟件包有affy, affyPLM, affycomp, gcrma等，這些軟件包都很有用。如果沒有安裝可以通過運行下面R語句安裝：

source("http://bioconductor.org/biocLite.R")

biocLite(c("affy","gcrma","affyPLM","affycomp"))

Affy芯片數據的預處理一般有三個步驟：背景處理（background adjustment），歸一化處理（normalization，或稱為“標準化處理”），匯總（summarization）。最后一步獲取表達水平數據。需要說明的是，每個步驟都有很多不同的處理方法（算法），選擇不同的處理方法對最終結果有非常大的影響。選擇哪種方法是仁者見仁智者見智，不同檔次的雜志或編輯可能有不同的偏好。

0、需要了解的一點Affy芯片基礎知識

Affy基因芯片的探針長度為25個堿基，每個mRNA用11~20個探針去檢測，檢測同一個mRNA的一組探針稱為probe sets。由于探針長度較短，為保證雜交的特異性，affy公司為每個基因設計了兩類探針，一類探針的序列與基因完全匹配，稱為perfect match（PM）probes，另一類為不匹配的探針，稱為mismatch （MM）probes。PM和MM探針序列除第13個堿基外完全一樣，在MM中把PM的第13個堿基換成了互補堿基。PM和MM探針成對出現。我們先使用前一節的方法載入數據并修改芯片名稱：

library(affy)

the.filter<-matrix(c("CEL file (*.cel)","*.cel","All (*.*)","*.*"),ncol=2,byrow=T)

cel.files<-choose.files(caption="Select CEL files",multi=TRUE,filters=the.filter,index=1)

data.raw<-ReadAffy(filenames=cel.files)

sampleNames(data.raw)<-paste("CHIP",1:length(cel.files),sep="")

用pm和mm函數可查看每個探針的檢測情況：

>pm.data.raw<-pm(data.raw)

>head(pm.data.raw,2)

CHIP1 CHIP2 CHIP3 CHIP4 CHIP5 CHIP6 CHIP7 CHIP8

501131127.0166.3112139.8111.385.5126.3102.8

251604118.5105.082101.594.081.3103.8103.0

>mm.data.raw<-mm(data.raw)

>head(mm.data.raw,2)

CHIP1 CHIP2 CHIP3 CHIP4 CHIP5 CHIP6 CHIP7 CHIP8

50184389.088.080.591.077.07579.072.0

252316134.377.377.0107.898.57599.571.3

上面顯示的列名稱就是探針的名稱。而基因名稱用probeset名稱表示：

>head(geneNames(data.raw))

[1]"244901_at""244902_at""244903_at""244904_at""244905_at""244906_at"

probeset不一定和實際基因一一對應，這些后面對探針進行基因名稱映射時會看到。

一、背景處理（background adjustment）

雖然說是背景處理，但是這一步既處理背景值，又處理噪聲信號。注意背景和噪聲是兩個概念，比如說鄉間夜晚的蛙叫聲雖嘈雜但很穩定，算是背景，如果突然來一聲狗叫，那就是噪聲。這兩者在統計上可以區分。

芯片的背景處理理論上很簡單，因為Affy公司設計MM的目的就是檢測非特異雜交信號，PM -MM 不就結了？但是研究發現居然有多達30%的MM探針獲得的信號強度比相應PM探針的還強（嘿嘿），所以啊，研究者的飯碗就出來了，整些看起來還合理的方法吧。

R軟件包affy用于芯片背景噪聲消減的函數是bg.correct()，而MAS和RMA方法是最常用的兩種方法。

MAS方法將芯片分為k（默認值為16）個網格區域，用每個區域使用信號強度最低的2%探針去計算背景值和噪聲。RMA方法的原理比較復雜，可以參看文獻：R. A. Irizarry, B. Hobbs, F. Collin, et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics, 4:249–64, 2003b. 11, 18, 27, 232, 241, 432, 443。

>data.rma<-bg.correct(data.raw,method="rma")

Loadingrequiredpackage:AnnotationDbi

>data.mas<-bg.correct(data.raw,method="mas")

>class(data.rma)

[1]"AffyBatch"

attr(,"package")

[1]"affy"

>class(data.mas)

[1]"AffyBatch"

attr(,"package")

[1]"affy"

>class(the.data)

[1]"AffyBatch"

attr(,"package")

[1]"affy"

可以看到：ReadAffy()讀入的CEL芯片數據以AffyBatch類數據形式存儲，而背景消減后得到的依然是AffyBatch類數據。

MAS方法應用后PM和MM的信號強度都被重新計算。RMA方法僅使用PM探針數據，背景調整后MM的信號值不變。

>head(pm(data.raw)-pm(data.mas),2)

CHIP1??? CHIP2??? CHIP3??? CHIP4??? CHIP5??? CHIP6??? CHIP7??? CHIP8

50113179.3434462.9287863.2347172.8700362.4808264.4335962.9744760.85734

25160477.5727463.0641563.7300180.6878463.0687366.5250963.3347760.33844

>head(pm(data.raw)-pm(data.rma),2)

CHIP1???? CHIP2??? CHIP3???? CHIP4??? CHIP5??? CHIP6???? CHIP7??? CHIP8

501131111.2499102.2057693.22705116.3628293.7457176.14978102.8209485.21383

251604103.879588.6881172.5728690.7481582.2269372.6360087.7493285.31779

>head(mm(data.raw)-mm(data.mas),2)

CHIP1??? CHIP2??? CHIP3??? CHIP4??? CHIP5??? CHIP6??? CHIP7??? CHIP8

50184379.3370862.9294263.2363172.8975462.4842064.4415862.9721660.85470

25231677.5618163.0636263.7313980.6620563.0707266.5130063.3311360.34233

>head(mm(data.raw)-mm(data.rma),2)#差值為全部為0，說明rma方法沒有對mm數值進行處理

CHIP1 CHIP2 CHIP3 CHIP4 CHIP5 CHIP6 CHIP7 CHIP8

50184300000000

25231600000000

二、歸一化處理（normalization）

同一個RNA樣品用相同類型的幾塊芯片進行雜交，獲得的結果（信號強度等）都不可能完全相同，甚至差別很大。為了使不同芯片獲得的結果具有可比性，必需進行歸一化處理。這一步的方法也很多。歸一化處理的affy函數為normalize( )，以Affybatch對象和處理方法為參數。

1、線性縮放方法：這是Affy公司在其軟件（4.0和5.0版本）中使用的方法。這種方法先選擇一個芯片作為參考，將其他芯片和參考芯片逐一做線性回歸分析，用回歸直線（沒有截距）對其他芯片的信號值做縮放。Affy公司的軟件做回歸分析前去除了2%最強和最弱信號。使用很簡單，mas方法做背景消減后做歸一化分析的R語句是：

>data.mas.ln<-normalize(data.mas,method="constant")

>head(pm(data.mas.ln)/pm(data.mas),5)

CHIP1? ? CHIP2? ? CHIP3? ? CHIP4? ? CHIP5? ? CHIP6? ? CHIP7? ? CHIP8

50113110.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

25160410.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

26189110.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

23038710.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

21733410.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

>head(mm(data.mas.ln)/mm(data.mas),5)

CHIP1? ? CHIP2? ? CHIP3? ? CHIP4? ? CHIP5? ? CHIP6? ? CHIP7? ? CHIP8

50184310.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

25231610.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

26260310.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

23109910.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

21804610.87876461.0021781.1405490.99288791.0294440.75775370.8833788

可以看出，線性縮放方法以第一塊芯片為參考，它的數值沒有被處理，而其他芯片都被縮放了。對同一塊芯片，不同探針的縮放倍數是一個常數。PM和MM的縮放方法完全一樣。

2、非線性縮放方法：此方法獲得的結果比線性方法要好，做非線性擬合時不是取整張芯片而僅取部分（一列）作為基線。

>data.mas.nl<-normalize(data.mas,method="invariantset")

>head(pm(data.mas.nl)/pm(data.mas),5)

CHIP1??? CHIP2??? CHIP3??? CHIP4??? CHIP5??? CHIP6???? CHIP7???? CHIP8

50113111.0496001.4169841.3592821.3991642.0231091.00857861.3123854

25160411.3483262.2789291.8378301.5866652.4305501.11258041.3059096

26189111.5640441.3973761.6751831.4966641.5564771.31673551.5508943

23038711.2587541.6829281.3898361.3601181.5038931.01445911.2238827

21733411.0093941.1265551.2414241.2294021.2629490.84172530.9933603

可以看到，同一芯片不同探針的信號值的縮放倍數是不一樣的。

3、分位數（quantile）方法：這種方法認為（或假設）每張芯片探針信號的經驗分布函數應完全一樣，使用任兩張芯片的數據做QQ圖應該得到一條斜率為1截距為0的直線。

>data.mas.qt<-normalize(data.mas,method="quantiles")

>head(pm(data.mas.qt)/pm(data.mas),5)

CHIP1???? CHIP2??? CHIP3??? CHIP4??? CHIP5??? CHIP6???? CHIP7???? CHIP8

5011310.71763740.96021341.1402331.1807011.1115931.1868050.81452381.0155723

2516040.69840190.98141221.1985101.2091941.1117261.1722720.82872131.0143434

2618910.69387050.99556101.1367341.2050781.1106201.1856080.83887291.0579171

2303870.76529230.97767551.1711231.1830991.1148641.1850520.81528250.9921032

2173340.95075450.95468441.0633201.1620731.1304111.1729860.79450020.9265588

4、其他：如循環局部加權回歸法（Cyclic loess）和 Contrasts方法。

data.rma.lo<-normalize(data.rma,method="loess")

data.rma.ct<-normalize(data.rma,method="contrasts")

三、匯總（Summarization）：

最后一步匯總是使用合適的統計方法通過probeset（包含多個探針）的雜交信號計算出計算表達量。affy包的函數為computeExprSet。需要注意的是computeExprSet函數除需要指定統計方法外還需要指定PM校正的方式：computeExprSet(x, pmcorrect.method, summary.method, ...)

兩個參數可以設定的值可以通過下面函數獲得：

>pmcorrect.methods()

[1]"mas""methods""pmonly""subtractmm"

>generateExprSet.methods()

[1]"avgdiff""liwong""mas""medianpolish""playerout"

常用的匯總方法是medianpolish, liwong和mas。liwong方法僅使用PM做背景校正（pmcorrect.method="pmonly"）。例如：

>eset.rma.liwong<-computeExprSet(data.rma.lo,pmcorrect.method="pmonly",summary.method="liwong")

22810ids to be processed

||

|####################|

共有29個警告(用warnings()來顯示)

計算過程需要一定的時間，耐心等候完成。最后的結果 ExpressionSet 類型數據：

>class(eset.rma.liwong)

[1]"ExpressionSet"

attr(,"package")

[1]"Biobase"

>class(data.raw)

[1]"AffyBatch"

attr(,"package")

[1]"affy"

四、三合一處理和“自動化”函數：

了解芯片預處理的原理和步驟后你完全可以用一個R函數完成三步處理。affy包提供的三合一處理函數為 expresso( )，用法為：

expresso(

afbatch,

# background correction

bg.correct = TRUE,

bgcorrect.method = NULL,

bgcorrect.param = list(),

# normalize

normalize = TRUE,

normalize.method = NULL,

normalize.param = list(),

# pm correction

pmcorrect.method = NULL,

pmcorrect.param = list(),

# expression values

summary.method = NULL,

summary.param = list(),

summary.subset = NULL,

# misc.

verbose = TRUE,

widget = FALSE)

例如：

eset.mas<-expresso(data.raw,bgcorrect.method="mas",normalize.method="constant",

pmcorrect.method="mas",summary.method="mas")

使用的各類方法可用bgcorrect.methods，pmcorrect.methods 和 express.summary.stat.methods函數了解。

expresso速度較慢，一些R軟件包提供速度較快的預編譯三合一函數，如affyPLM軟件包的threestep函數。affyPLM提供的處理方法很豐富，有興趣可以自學。

下面介紹介3個“自動化”函數，這些函數已經預定義了預處理各步驟所采用的方法和參數，不再需要設定。

1、mas5函數，由affy包提供：

>eset.mas5<-mas5(data.raw)

background correction:mas

PM/MM correction:mas

expression values:mas

background correcting...done.

22810ids to be processed

||

|####################|

mas5據說是expresso函數和mas方法的封裝。但使用下面語句獲得的結果似乎與 mas5(data.raw)的結果不一樣（自己去驗證看看）：

expresso(data.raw, bgcorrect.method="mas", normalize=FALSE, pmcorrect.method="mas", summary.method="mas")

2、rma函數，也是由affy包提供，其背景處理方法為rma法，歸一化處理使用分位數法，而匯總方法使用medianpolish：

eset.rma<-rma(data.raw)

它等價于：

eset.rma<-expresso(data.raw,bgcorrect.method="rma",normalize.method="quantiles",pmcorrect.method="pmonly",summary.method="medianpolish")

但rma函數是預編譯好的C語言函數，速度非常快！

3、gcrma函數，由gcrma包提供：

Affy的軟件（比如mas方法）使用MM數據做背景處理，但由于MM出現的問題（上面提到過），這些方法可能高估了背景值。而rma方法在做背景處理時沒有使用MM數據，這可能又低估了背景值。MM序列公布后有人對其特異性進行了評估，并使用這些評估結果建立了新方法。gcrma就是這樣的方法，也是封裝好的三合一方法。

>eset.gcrma<-gcrma(data.raw)

Adjustingforoptical effect........Done.

Computingaffinities.Done.

Adjustingfornon-specific binding........Done.

Normalizing

CalculatingExpression

五、芯片處理方法的優劣評估

芯片預處理的方法這么多，哪個好？我選哪個？知道得越多越迷惑。幸好這些已經有人做了，牛人Rafael Irizarry 和 Leslie Cope專門寫了一個R軟件包affycomp用于方法評估。

評估方法的優劣必需有數據，而且是包含已知因素的數據。affycomp需要兩個系列的數據，一個是RNA稀釋系列芯片數據，稱為Dilution data，另一個是使用了內參/外標RNA的芯片，稱為Spike-in data。Spike-in RNA是在目標物種中不存在、但在芯片上含有相應檢測探針的RNA，比如Affy的擬南芥芯片上有幾個人或細菌的基因檢測探針。由于稀釋倍數已知，內參/外標的RNA量和雜交特異性也已知，所以結果可以預測，也就可以用做方法評估。對于嚴格的芯片實驗來說，這些實驗都是必須的。但是絕大多數人不做，因為成本很高，尤其是只做幾張芯片的時候，一般直接使用別人認可的方法如RMA或MAS。下面是affycomp說明文檔比較MAS5和RMA方法優劣的一個演示圖，軟件具體用法此處不做介紹：