“差異”是個統計學概念，獲取差異表達基因就要用統計方法，R的統計功能很強大，適合做這樣的事情。用前面的方法讀取數據：
library(affy)library(tcltk)filters<-matrix(c("CEL file",".[Cc][Ee][Ll]","All",".*"),ncol=2,byrow= T)cel.files<-tk_choose.files(caption="Select CELs",multi=TRUE,filters= filters,index=1)data.raw<-ReadAffy(filenames= cel.files)n.cel<-length(cel.files)# 查看樣品名稱sampleNames(data.raw)
## [1] "NRID9780_Zarka_2-1_MT-0HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [2] "NRID9781_Zarka_2-2_MT-0HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [3] "NRID9782_Zarka_2-3_MT-1HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [4] "NRID9783_Zarka_2-4_MT-1HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [5] "NRID9784_Zarka_2-5_MT-24HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [6] "NRID9785_Zarka_2-6_MT-24HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
## [7] "NRID9786_Zarka_2-7_MT-7DCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL"
## [8] "NRID9787_Zarka_2-8_MT-7DCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
# 簡化一下名稱，設置pDatasampleNames(data.raw)<-paste("S",1:n.cel,sep='')pData(data.raw)$treatment<-rep(c("0h","1h","24h","7d"),each=2)pData(data.raw)
##? ? sample treatment
## S1? ? ? 1? ? ? ? 0h
## S2? ? ? 2? ? ? ? 0h
## S3? ? ? 3? ? ? ? 1h
## S4? ? ? 4? ? ? ? 1h
## S5? ? ? 5? ? ? 24h
## S6? ? ? 6? ? ? 24h
## S7? ? ? 7? ? ? ? 7d
## S8? ? ? 8? ? ? ? 7d
使用rma和mas5方法進行預處理：
eset.rma<-rma(data.raw)
## Background correcting
## Normalizing
## Calculating Expression
eset.mas5<-mas5(data.raw)
## background correction: mas
## PM/MM correction : mas
## expression values: mas
## background correcting...done.
## 22810 ids to be processed
## |? ? ? ? ? ? ? ? ? ? |
## |####################|
很簡單，用一個exprs函數就可以從eset數據中提取出表達量，得到的數據類型是矩陣。但是應該注意rma的eset結果是經過對數變換的，而mas5的eset結果是原始信號強度。雖然表達量是用對數變換的信號值表示的，但是有些計算過程要用到未經變換的原始值，應該把它們都計算出來：
emat.rma.log2<-exprs(eset.rma)emat.mas5.nologs<-exprs(eset.mas5)class(emat.rma.log2)
## [1] "matrix"
head(emat.rma.log2,1)
##? ? ? ? ? ? S1? ? S2? ? S3? ? S4? ? S5? ? S6? S7? ? S8
## 244901_at 4.04 4.348 4.048 4.052 4.019 3.962 4.03 4.062
head(emat.mas5.nologs,1)
##? ? ? ? ? ? ? S1? ? S2? ? S3? ? S4? ? S5? ? S6? ? S7? ? S8
## 244901_at 39.79 94.94 57.35 60.23 61.08 55.57 53.95 85.98
emat.rma.nologs<-2^emat.rma.log2emat.mas5.log2<-log2(emat.mas5.nologs)
下面我們僅使用rma的結果做演示。計算平均表達量和差異表達倍數（和0h對照比）：
rm(eset.mas5)rm(emat.mas5.nologs)rm(emat.mas5.log2)#計算平均值，并做對數轉換results.rma<-data.frame((emat.rma.log2[,c(1,3,5,7)]+emat.rma.log2[,c(2,4,6,8)])/2)#計算表達量差異倍數results.rma$fc.1h<-results.rma[,2]-results.rma[,1]results.rma$fc.24h<-results.rma[,3]-results.rma[,1]results.rma$fc.7d<-results.rma[,4]-results.rma[,1]head(results.rma,2)
##? ? ? ? ? ? ? S1? ? S3? ? S5? ? S7? fc.1h? fc.24h? fc.7d
## 244901_at 4.194 4.050 3.991 4.046 -0.1448 -0.2037 -0.1481
## 244902_at 4.293 4.159 4.061 3.937 -0.1340 -0.2316 -0.3557
簡單補充介紹一下R語言中取數據子集的三種方法，主要是矩陣和數據框：
用下標子集取數據子集::比如上面用到的eset.rma[, c(1,3,5,7)]。由于eset.rma是2維矩陣，eset.rma[, c(1,3,5,7)]的第一維留空（逗號前不寫東西）表示取全部的行，第二維下標的取值為向量c(1,3,5,7)，表示取1,3,5,7共4列。
用行、列名稱取子集::eset.rma[c("244901_at", "244902_at"), ]的第一維（行）是名稱向量為c("244901_at", "244902_at")，第二維留空，表示取數據中行名稱為c("244901_at", "244902_at")的所有列。同樣方法可應用在列選取上。
用邏輯向量取子集::比如我們要選取results.rma中fc.7d大于0的所有行，分兩步：先產生一個邏輯向量，然后用這個邏輯向量取子集，也可以一步完成。
subset.logic<-results.rma$fc.7d>0subset.data<-results.rma[subset.logic,]
要注意的是邏輯向量的長度要和相應維度的數據長度一致，邏輯向量中為TRUE的就保留，FALSE的就丟棄：
length(subset.logic);nrow(results.rma)
## [1] 22810
head(subset.logic)
## [1] FALSE FALSE FALSE FALSE? TRUE? TRUE
很多人可能不做這一步，認為沒必要。但是理論上說，芯片可以檢測的基因不一定在樣品中都有表達，對于樣本量較小的非“pooled”樣品來說這是肯定的。把芯片上所有基因當成樣本中的表達基因去做統計分析顯然不合適。
選取“表達”基因的方法常見的有兩種，一是使用genefilter軟件包，另外一種是調用affy包的mas5calls()函數。使用 genefilter需要設定篩選閾值，不同的人可能有不同的標準，稍嫌隨機，不夠自動化，不介紹了。mas5calls方法使用探針水平數據（AffyBatch類型數據）進行處理，一般使用沒經過預處理的芯片數據通用性強些，其他參數用默認就可以：
data.mas5calls<-mas5calls(data.raw)
## Getting probe level data...
## Computing p-values
## Making P/M/A Calls
繼續用exprs計算“表達”量，得到的數據只有三個值P/M/A。對于這三個值的具體解釋可以用?mas5calls查看幫助。P為present，A為absent，M為marginal（臨界值）。
eset.mas5calls<-exprs(data.mas5calls)head(eset.mas5calls)
##? ? ? ? ? S1? S2? S3? S4? S5? S6? S7? S8
## 244901_at "A" "P" "P" "A" "P" "P" "A" "P"
## 244902_at "A" "P" "P" "M" "A" "A" "P" "A"
## 244903_at "P" "P" "P" "P" "P" "P" "P" "P"
## 244904_at "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A"
## 244905_at "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A"
## 244906_at "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A"
下面我們把至少一個芯片中有表達的基因選出來：從22810中選出了16005個。
AP<-apply(eset.mas5calls,1,function(x)any(x=="P"))present.probes<-names(AP[AP])paste(length(present.probes),"/",length(AP))
## [1] "16005 / 22810"
刪掉一些中間數據很必要：
rm(data.mas5calls)rm(eset.mas5calls)
present.probes是名稱向量，用它進行數據子集提?。?/p>
results.present<-results.rma[present.probes,]
生物學數據分析時的"差異"應該有兩個意思，一是統計學上的差異，另外一個是生物學上的差異。一個基因在兩個條件下的表達量分別有3個測量值：99,100,101 和 102,103,104。統計上兩種條件下的基因表達數值是有差異的，后者比前者表達量要大。但生物學上有意義嗎？未必。按平均值計算表達變化上升了3%，能產生什么樣的生物學效應？這得看是什么基因了。所以差異表達基因的選取一般設置至少兩個閾值：基因表達變化量和統計顯著性量度（p值、q值等）。
這種方法不用太多的統計學知識，生物專業的人很容易想到，而且確實有不少人在用。經常使用的篩選閾值是表達量變化超過2倍，即|log2(fc)|>=log(2)。先簡單看看有沒有：
apply(abs(results.present[,5:7]),2, max)
##? fc.1h fc.24h? fc.7d
##? 5.309? 6.688? 6.844
apply是一個很有用的函數，它對數據按某個維度批量應用一個函數進行計算。第一個參數為向量或矩陣（或者是能轉成向量或矩陣的數據，如數據框），第三個參數表示要使用的函數，第二個參數為應用的維度。上面語句的意思是對數據 abs(results.present[,5:7]) 按列（第二維）使用統計函數max（計算最大值）。表達變化超過2倍的基因共有842個：
sum(abs(results.present[,"fc.7d"])>=log2(2))
## [1] 842
選出這842個基因：
results.st<-results.present[abs(results.present$fc.7d)>=log2(2),]sel.genes<-row.names(results.st)
t測驗，并選出p<0.05的差異表達基因：
p.value<-apply(emat.rma.log2[sel.genes,],1,function(x){t.test(x[1:2], x[7:8])$p.value})results.st$p.value<-p.valuenames(results.st)
## [1] "S1"? ? ? "S3"? ? ? "S5"? ? ? "S7"? ? ? "fc.1h"? "fc.24h"? "fc.7d"
## [8] "p.value"
results.st<-results.st[,c(1,4,7,8)]results.st<-results.st[p.value<0.05,]head(results.st,2)
##? ? ? ? ? ? ? S1? ? S7? fc.7d p.value
## 245042_at 8.153 7.021 -1.133 0.01004
## 245088_at 7.041 5.419 -1.622 0.03381
nrow(results.st)
## [1] 347
通過簡單t測驗方法得到347個表達倍數變化超過2倍的差異表達基因。
3.2SAM（Significance Analysis of Microarrays）
R軟件包samr可以做這個。得先安裝：
library(BiocInstaller)biocLite("samr")
這種方法流行過一段時間，但由于FDR（錯誤檢出率）控制太差，現在基本不用了。
要用也不復雜。但是注意SAM函數使用的emat表達數據是present.probes篩選出來的“表達”基因子集，如果你用沒有經過篩選的數據，得到的結果會差別很大，不信可以自己試試（這點可能也是這種方法的毛病之一）：
library(samr)samfit<-SAM(emat.rma.nologs[present.probes,c(1,2,7,8)],c(1,1,2,2),resp.type="Two class unpaired",genenames=present.probes)
## perm= 1
## perm= 2
## perm= 3
## perm= 4
## perm= 5
## perm= 6
## perm= 7
## perm= 8
## perm= 9
## perm= 10
## perm= 11
## perm= 12
## perm= 13
## perm= 14
## perm= 15
## perm= 16
## perm= 17
## perm= 18
## perm= 19
## perm= 20
## perm= 21
## perm= 22
## perm= 23
## perm= 24
##
## Computing delta table
## 1
## 2
## 3
## 4
## 5
## 6
## 7
## 8
## 9
## 10
## 11
## 12
## 13
## 14
## 15
## 16
## 17
## 18
## 19
## 20
## 21
## 22
## 23
## 24
## 25
## 26
## 27
## 28
## 29
## 30
## 31
## 32
## 33
## 34
## 35
## 36
## 37
## 38
## 39
## 40
## 41
## 42
## 43
## 44
## 45
## 46
## 47
## 48
## 49
## 50
SAM函數返回值一個列表結構，可以自己用?SAM看看。差異表達基因的數據在siggenes.table中，也是一個列表結構：
str(samfit$siggenes.table)
## List of 5
##? $ genes.up? ? ? ? ? : chr [1:6748, 1:7] "265483_at" "248583_at" "253183_at" "252409_at" ...
##? ..- attr(*, "dimnames")=List of 2
##? .. ..$ : NULL
##? .. ..$ : chr [1:7] "Gene ID" "Gene Name" "Score(d)" "Numerator(r)" ...
##? $ genes.lo? ? ? ? ? : chr [1:5341, 1:7] "259382_s_at" "248748_at" "249658_s_at" "266863_at" ...
##? ..- attr(*, "dimnames")=List of 2
##? .. ..$ : NULL
##? .. ..$ : chr [1:7] "Gene ID" "Gene Name" "Score(d)" "Numerator(r)" ...
##? $ color.ind.for.multi: NULL
##? $ ngenes.up? ? ? ? ? : int 6748
##? $ ngenes.lo? ? ? ? ? : int 5341
上調基因在siggenes.table的genes.up中，下調基因在genes.lo中。從上面的數據結構顯示還可以看到差異表達基因的數量： ngenes.up和ngenes.lo。提取差異表達基因數據：
results.sam<-data.frame(rbind(samfit$siggenes.table$genes.up,samfit$siggenes.table$genes.lo),row.names=1,stringsAsFactors=FALSE)for(iin1:ncol(results.sam)) results.sam[,i]<-as.numeric(results.sam[,i])head(results.sam,2)
##? ? ? ? ? Gene.Name Score.d. Numerator.r. Denominator.s.s0. Fold.Change
## 265483_at? ? 14534? ? 222.3? ? ? ? 22.48? ? ? ? ? ? 0.101? ? ? 1.989
## 248583_at? ? ? 2667? ? 186.8? ? ? ? 88.45? ? ? ? ? ? 0.473? ? ? 1.670
##? ? ? ? ? q.value...
## 265483_at? ? ? ? ? 0
## 248583_at? ? ? ? ? 0
應用表達倍數進行篩選，有861個基因表達變化超過2倍（和前面簡單t測驗結果僅差1個，說明t測驗還是可以的嘛?。?/p>
results.sam<-results.sam[abs(log2(results.sam$Fold.Change))>=log2(2), ] ;nrow(results.sam)
## [1] 861
應用q值篩選，q<0.05只有10個，而q<0.1則有685個，選擇篩選閾值也成了這種方法的一個問題：
#samr的q值表示方式為%，即5表示5%nrow(results.sam[results.sam$q.val<5,])
## [1] 10
nrow(results.sam[results.sam$q.val<10,])
## [1] 685
3.3Wilcoxon's signed-rank test
這個方法發表在 Liu, W.-m. et al, Analysis of high density expression microarrays with signed-rank call algorithms. Bioinformatics, 2002, 18, 1593-1599。R軟件包simpleaffy的detection.p.val函數有實現，可以通過pairwise.comparison函數調用：
library(simpleaffy)#注意下面語句中的數據順序sa.fit<-pairwise.comparison(eset.rma,"treatment",c("7d","0h"))
pairwise.comparison返回的數據為simpleaffy自定義的"PairComp"類型，提取數據要用它專門的函數：平均值用means函數獲得，變化倍數（log2）用fc函數獲得，t測驗的p值用tt函數獲得：
class(sa.fit)
## [1] "PairComp"
## attr(,"package")
## [1] "simpleaffy"
results.sa<-data.frame(means(sa.fit),fc(sa.fit),tt(sa.fit))#選擇有表達的基因results.sa<-results.sa[present.probes,]head(results.sa,2)
##? ? ? ? ? ? X7d? X0h fc.sa.fit. tt.sa.fit.
## 244901_at 4.047 4.203? ? -0.1562? ? 0.43982
## 244902_at 3.938 4.295? ? -0.3570? ? 0.05824
colnames(results.sa)<-c("7d","0h","fold.change","p.val")head(results.sa,2)
##? ? ? ? ? ? ? 7d? ? 0h fold.change? p.val
## 244901_at 4.047 4.203? ? -0.1562 0.43982
## 244902_at 3.938 4.295? ? -0.3570 0.05824
應用表達倍數篩選得到表達倍數超過2倍的基因數量有862個，應用p值篩選后得到562個差異表達基因：
results.sa<-results.sa[abs(results.sa$fold.change)>=log2(2), ];nrow(results.sa)
## [1] 862
results.sa<-results.sa[results.sa$p.val<0.05,];nrow(results.sa)
## [1] 562
這種方法在R軟件包limma里面實現得最好。limma最初主要用于雙色（雙通道）芯片的處理，現在不僅支持單色芯片處理，新版還添加了對RNAseq數據的支持，很值得學習使用。安裝方法同前面其他Bioconductor軟件包的安裝。載入limm軟件包后可以用limmaUsersGuide()函數獲取pdf格式的幫助文檔。
limma的功能很多，這里只看看差異表達基因的分析流程，具體算法原理請參考limma在線幫助和這篇文獻：Smyth G K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments[J]. Statistical applications in genetics and molecular biology, 2004, 3(1): 3.
limma需要先產生一個design矩陣，用于描述RNA樣品：
library(limma)treatment<-factor(pData(eset.rma)$treatment)design<-model.matrix(~0+treatment)colnames(design)<-c("C0h","T1h","T24h","T7d")design
##? C0h T1h T24h T7d
## 1? 1? 0? ? 0? 0
## 2? 1? 0? ? 0? 0
## 3? 0? 1? ? 0? 0
## 4? 0? 1? ? 0? 0
## 5? 0? 0? ? 1? 0
## 6? 0? 0? ? 1? 0
## 7? 0? 0? ? 0? 1
## 8? 0? 0? ? 0? 1
## attr(,"assign")
## [1] 1 1 1 1
## attr(,"contrasts")
## attr(,"contrasts")$treatment
## [1] "contr.treatment"
可以看到：矩陣的每一行代表一張芯片，每一列代表一種RNA來源（或處理）。此外，你可能還需要另外一個矩陣，用來說明你要進行哪些樣品間的對比分析：
contrast.matrix<-makeContrasts(T1h-C0h, T24h-C0h, T7d-C0h,levels=design)contrast.matrix
##? ? ? Contrasts
## Levels T1h - C0h T24h - C0h T7d - C0h
##? C0h? ? ? ? -1? ? ? ? -1? ? ? ? -1
##? T1h? ? ? ? ? 1? ? ? ? ? 0? ? ? ? 0
##? T24h? ? ? ? 0? ? ? ? ? 1? ? ? ? 0
##? T7d? ? ? ? ? 0? ? ? ? ? 0? ? ? ? 1
下一步建立線性模型，并進行分組比較和p值校正：
fit<-lmFit(eset.rma[present.probes,], design)fit2<-contrasts.fit(fit, contrast.matrix)fit2<-eBayes(fit2)
先統計一下數量?？梢钥吹剑簩τ赥7d-C0h比較組（coef=3），表達變化超過2倍（lfc參數）的基因數為842個，而變化超過2倍、p<0.05的基因總數為740個：
nrow(topTable(fit2,coef=3,adjust.method="fdr",lfc=1,number=30000))
## [1] 842
nrow(topTable(fit2,coef=3,adjust.method="fdr",p.value=0.05,lfc=1,number=30000))
## [1] 740
把toTable函數的返回結果存到其他變量就可以了，它是數據框類型數據，可以用write或write.csv函數保存到文件：
results.lim<-topTable(fit2,coef=3,adjust.method="fdr",p.value=0.05,lfc=1,number=30000)class(results.lim)
## [1] "data.frame"
head(results.lim)
##? ? ? ? ? ? logFC AveExpr? ? ? t? P.Value adj.P.Val? ? ? B
## 254818_at? 6.215? 10.363? 41.38 7.304e-10 1.169e-05 11.538
## 254805_at? 6.844? 7.280? 30.81 6.095e-09 4.878e-05 10.431
## 245998_at? 2.778? 10.011? 25.44 2.411e-08 9.545e-05? 9.528
## 265119_at? 4.380? 8.282? 24.07 3.588e-08 9.545e-05? 9.240
## 256114_at? 4.461? 7.668? 23.92 3.745e-08 9.545e-05? 9.208
## 265722_at -2.913? 9.276 -23.91 3.760e-08 9.545e-05? 9.205
為什么以上幾種方法僅用表達倍數（2倍）篩選得到的數字不大一樣？limma和直接計算的結果都是842個，而simpleaffy和SAM為862/861個。這是對eset信號值取對數和求平均值的先后導致的，limma先取對數再求平均值，而simpleaffy和SAM是先求平均值再取對數。
如Rank products方法，在R軟件包RankProd里實現，方法文獻為：Breitling R, Armengaud P, Amtmann A, et al. Rank products: a simple, yet powerful, new method to detect differentially regulated genes in replicated microarray experiments[J]. FEBS letters, 2004, 573(1): 83-92.
最后我們保存部分數據備下次使用：
#所有表達基因的名稱write(present.probes,"genes.expressed.txt")#處理7天的差異表達基因write.csv(results.lim,"results.lim.7d.csv")#emat.rma.log2write.csv(emat.rma.log2[present.probes,],"emat.rma.log2.csv")
如果要全部結果：
results.lim.all<-topTable(fit2,coef=1:3,adjust.method="fdr",p.value=1,lfc=0,number=30000)head(results.lim.all,3)
##? ? ? ? ? T1h...C0h T24h...C0h T7d...C0h AveExpr? ? ? F? P.Value
## 254818_at? 0.34085? ? ? 6.024? ? 6.215? 10.363 1048.0 6.704e-10
## 245998_at? -0.13675? ? ? 3.676? ? 2.778? 10.011? 630.3 4.192e-09
## 265119_at? -0.02536? ? ? 6.061? ? 4.380? 8.282? 579.6 5.671e-09
##? ? ? ? ? adj.P.Val
## 254818_at 1.073e-05
## 245998_at 3.025e-05
## 265119_at 3.025e-05
## 僅保存logFC供后面的分析使用results.lim.all<-results.lim.all[,1:3]colnames(results.lim.all)<-c('T1h','T24h','T7d')head(results.lim.all,3)
##? ? ? ? ? ? ? ? T1h? T24h? T7d
## 254818_at? 0.34085 6.024 6.215
## 245998_at -0.13675 3.676 2.778
## 265119_at -0.02536 6.061 4.380
write.csv(results.lim.all,'results.lim.all.csv')
sessionInfo()
## R version 3.1.0 (2014-04-10)
## Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit)
##
## locale:
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