m6A-immune-related lncRNA prognostic signature for predicting immune landscape and prognosis of bladder cancer
用于預測膀胱癌免疫狀況和預后的m6A-免疫相關lncRNA預后特征
發表期刊：J Transl Med
發表日期：2022 Oct 29
影響因子：8.440
DOI:? 10.1186/s12967-022-03711-1
一、研究背景
????????膀胱癌是全球第十大最常見的惡性腫瘤，每年在全球造成約17萬人死亡。長非編碼RNAs（lncRNAs）長度超過200個核苷酸，一般不能轉化為蛋白質。lncRNAs通過轉錄和轉錄后調節基因表達，參與細胞生長、分化和增殖。以前的報告顯示，lncRNAs的表達失調在膀胱癌的致瘤性和轉移中至關重要。
????????作為最常見的RNA修飾，N6-甲基腺苷（m6A）不僅出現在信使RNA（mRNA）中，也出現在lncRNA中。m6A甲基化幾乎影響了所有的RNA代謝環節，包括RNA易位、剪接、穩定和翻譯。
二、材料與方法
1、數據來源
1）從TCGA數據庫獲取膀胱癌突變數據、轉錄組數據和相應的臨床信息
2）從GEO獲取GSE154261數據集
3）T24和RT-112，兩個膀胱癌細胞系
2、分析流程
1）鑒定與m6A免疫相關的lncRNAs：lncRNAs和m6A調節器之間的Pearson's相關性分析；分析lncRNAs和CIBERSORT免疫組分之間的相關性；Univariate Cox比例風險回歸分析
2）m6A免疫相關lncRNA風險模型的構建和驗證：LASSO Cox回歸；患者被劃分為低風險組和高風險組，從多個維度分析高危組和低危組的差異，包括臨床特征、這些lncRNAs和m6A調節器的表達水平、免疫浸潤估計（TIMER、CIBERSORT和TCIA）、細胞干性指數、腫瘤突變負擔和常見突變基因
3）m6A-免疫相關lncRNA風險模型的驗證：風險模型的預后能力是用KM生存曲線來評估的
4）基因集富集分析（GSEA）和通路注釋：GSEA是在R軟件中使用 "clusterprofiler "包進行的
5）細胞系和細胞培養、傷口愈合和侵襲試驗、菌落形成試驗
三、實驗結果
01 - 識別膀胱癌中與m6A免疫相關的lncRNAs
????????圖1A為工作流程，共有814個lncRNAs被納入本研究中。通過Pearson相關分析，618個lncRNAs被確定為與至少一個m6A調節因子有顯著相關性（圖1B）。同樣，通過Pearson相關分析，490個lncRNAs被確定為與免疫有關的lncRNAs，這些lncRNAs與CIBERSORT免疫組分之間的相關性分析（圖1C）。使用lncRNAs Univariate Cox回歸分析篩選出總生存期和無進展生存期相關的預后，49個lncRNAs顯示出預后價值（圖1D）。圖1E顯示了這47個共享的lncRNAs和CIBERSORT免疫分型以及m6A調節器之間的相關性。
02 - 構建m6A-免疫相關的lncRNA風險評分及其與臨床病理特征的相關性
????????對與m6A調節劑和CIBERSORT免疫組分都有明顯相關性的共同lncRNA進行LASSO-Cox回歸分析，構建預測總生存期的風險評分。圖2A是使用11個選定的lncRNAs構建的風險模型，圖2B是每個lncRNA的系數，圖2C是無進展生存期、總生存期和疾病特異性生存期的森林圖。計算風險分數，并根據中值將其分為低風險或高風險亞組。圖2D顯示了風險分數和臨床病理特征之間的相關性。較高的風險分數表明膀胱癌患者的分期較晚，大多數高危組腫瘤為基底鱗狀亞型，而大多數低危組腫瘤為腔內乳頭狀亞型。圖2E顯示了預后較差的高危組。
????????使用ROC曲線評估了風險模型的可靠性和敏感性，但是僅依靠風險評分的風險模型可能不足以預測患者的預后。因此，風險評分與其他關鍵的臨床特征相結合，包括診斷年齡、病理腫瘤分期和三個綜合nomogram，對OS、PFS和DSS進行了預測。圖3A-C顯示了高危組和低危組的無進展生存期、總生存期和疾病特異性生存期的Kaplan-Meier圖的比較。通過使用 "timeROC "軟件包中的時間依賴性ROC分析，圖3A-C顯示了這三個nomogram在1、3和5年的AUC。所有1年的AUC都大于0.74，表明該模型顯示出重要的預后價值。為了驗證該模型的預測準確性，作者將其應用于GEO（GSE154261）的一個獨立數據集，該數據集提供了總生存數據。ROC分析表明，該模型的AUC接近于TCGA數據集的AUC，表明該模型在其他數據集中是穩健的（圖3D）。
03 - 高危組和低危組之間的腫瘤突變率、突變負擔和腫瘤免疫微環境評分的比較
????????確定了風險評分與腫瘤突變率、突變負擔、腫瘤免疫微環境評分和腫瘤干性指數之間的關系。膀胱癌中一些常見的突變基因在低風險組和高風險組之間表現出明顯的差異。低危組中KDM6A的突變率比高危組低12%（圖4A）。低風險組的患者有較高的突變負擔（圖4B）。Immunophenoscore被用來預測膀胱癌患者對免疫檢查點抑制劑（ICI）的潛在反應。統計分析結果顯示，低風險組的免疫分值比高風險組大，這意味著低風險組的患者可能有更強的免疫原性，可能對免疫療法更敏感（圖4C）。使用腫瘤免疫評估資源（TIMER）算法計算，高危組的所有浸潤性免疫細胞，包括CD4 +和CD8 + T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、B細胞和巨噬細胞都比低危組的豐富（圖4D）。有趣的是，低風險組顯示出更高的干性指數，表明細胞干性和免疫原性在膀胱癌中發揮不同的作用（圖4E）。相關矩陣顯示了風險分數和這些因素之間的關系（圖4F）。21個m6A調節因子和11個m6A免疫相關的lncRNAs的表達熱圖顯示了它們與風險評分的關系（圖4G，H）。按風險評分對患者進行分類，在CIBERSORT餾分的熱圖中可以觀察到腫瘤微環境的明顯轉變（圖4I）。低風險組巨噬細胞的浸潤比例明顯低于高風險組，而高風險組的幼稚T細胞則縮減。
04 - GSEA和通路相關分析
????????作者進行了GSEA，以確定與該風險模型相關的途徑。如圖5a所示，"go_stem_cell_proliferation"、"go_epithelial_cell_proliferation"、"hallmark_epithelial_mesenchymal_transition"、"go_regulation_of_stem_cell_differentiation"、"go_negative_regulation_of_b_cell_activation" "GO_NEGATIVE_REGULATION_OF_IMMUNE_RESPONSE"、"GO_NEGATIVE_REGULATION_OF_MACROPHAGE_ACTIVATION "和"GO_NEGATIVE_REGULATION_OF_T_CELL_MEDIATED_IMMUNITY "與風險評分明顯呈正相關。這一結果表明，該模型與腫瘤的增殖、遷移、侵襲和腫瘤免疫微環境高度相關。通過使用R語言中的 "Pathview "和 "ggnetwork "包，這些通路之間的關系被可視化（圖5B，C）。11個lncRNAs和它們最相關的免疫基因之間的關系也被可視化了（圖5D）。
05 - GDSC的藥物敏感性分析和體外驗證
????????將風險模型應用于CCLE，并計算出膀胱癌細胞系的風險得分。如圖6A所示，T24的風險得分最高，而RT-112的風險得分最低），與以前的膀胱癌研究一致，表明T24的惡性程度相對高于其他細胞系。作者通過進行集落形成、傷口愈合和侵襲試驗，進一步在體外驗證了這些結果（圖6B-D）。此外，通過在GDSC中應用藥物敏感性數據，在細胞系風險評分和藥物IC50值之間進行了Pearson相關分析。在風險分數和塔拉唑帕里的IC50之間發現了明顯的負相關，這意味著風險分數高的患者對塔拉唑帕里更敏感（圖6E）。計算了塔拉唑帕里在T24中的IC50（2μM）（圖6F），并進行了菌落形成試驗，結果顯示T24細胞對塔拉唑帕里敏感（圖6G-I）。這可能為膀胱癌的靶向治療提供理論依據。
四、結論
????????從TCGA-BLCA隊列中發現了11個與m6A免疫相關的lncRNAs，并構建了一個具有強大預后價值的風險評分模型。這個模型可以預測膀胱癌患者對免疫療法的反應。本研究結果對m6A-免疫相關lncRNAs在膀胱癌腫瘤發生、發展和腫瘤免疫微環境構建中的功能提供了重要的見解。
