導言

今天小編分享一篇2020年4月3日發表于Nature Communications的文章——An oncopeptide regulates m6A recognition by the m6A reader IGF2BP1 and tumorigenesis. N6-甲基腺苷（m6A）是真核RNA中最普遍的修飾。m6A的生物學重要性取決于控制 mRNA 命運和功能的m6A閱讀蛋白。然而，m6A閱讀蛋白的其他調控亞基是否參與RNA的m6A識別尚待探討。在這里，研究者發現長鏈非編碼RNA（LncRNA）LINC00266-1編碼71個氨基酸肽。該肽主要與包括m6A閱讀蛋白IGF2BP1 在內的RNA 結合蛋白相互作用，因此被稱為“RNA結合調節肽”（RBRP）。RBRP與IGF2BP1結合并增強IGF2BP1對RNA（例如c-Myc mRNA）的m6A識別，從而增加mRNA的穩定性和c-Myc的表達，促進腫瘤發生。高表達RBRP的癌癥患者預后較差，因此由LINC00266-1編碼的癌肽RBRP 是m6A閱讀蛋白的調節亞基，并通過m6A閱讀蛋白增強對靶RNA的m6A識別，從而發揮致癌作用。

前期研究

目前研究發現具有編碼功能的LncRNA都必須與核糖體結合，所以作者對SW480和SW620細胞的核糖體結合的LncRNA進行測序，得到384個有差異表達的LncRNA，再通過軟件分析找出55個具有編碼潛力的LncRNA。進一步篩選了10個LncRNA，分別與起始密碼子突變的GFP（GFPmut）的N末端融合，將構建體轉染到HeLa細胞中檢測GFP熒光。結果發現只有LINC00266-1和FLJ20021的ORF能夠被翻譯（圖a）。通過對LINC00266-1的分析，研究者發現一個213個核苷酸的短ORF，參與編碼71-aa肽，將其命名為RBRP。通過序列比較，表明RBRP是一個未被鑒定過的肽。在 LINC00266-1 ORF-Flag（ORF）和5'UTR-ORF-Flag（5'U）轉染的細胞中觀察到RBRP-Flag融合肽的大量表達，而起始密碼子ATG（5' UTR-ORFmut-Flag，MT）取消了LINC00266-1中預測的ORF的翻譯（圖b，c）。進一步將LINC00266-1 ORF-GFPmut融合構建體轉染到HEK293T細胞中，使用GFP抗體免疫沉淀RBRP-GFP融合肽，質譜鑒定RBRP肽中兩個獨特的肽片段（圖d）。

接下來，研究者鑒定具有編碼潛力的LncRNA。用抗RBRP抗體檢測細胞RBRP肽驗證細胞和組織中天然內源性RBRP肽的存在和表達。在結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和鼻咽癌細胞中驗證了天然內源性RBRP肽（圖a，b）。此外，RBRP肽被證實是天然內源性的在五對配對的新鮮原發性結直腸癌組織及其相應的鄰近非腫瘤性結直腸組織中產生（圖c）。最后，利用MS分析鑒定了天然內源性RBRP肽中的三個獨特肽片段進一步表明天然內源性RBRP肽存在于癌癥組織中。通過Kaplan-Meier生存分析顯示，RBRP水平較高的結直腸癌患者的癌癥相關死亡風險高于RBRP水平較低的患者，并且高RBRP水平與結直腸癌患者不良預后之間存在顯著的相關性（圖f-g）。前期的研究結果表明，RBRP可能是一個潛在的致癌基因。

功能驗證

為了研究LINC00266-1有沒有直接致癌作用，研究者通過shRNA直接把其敲低，通過腫瘤細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲檢測發現：敲除LINC00266-1后，細胞生長、集落形成、遷移和侵襲顯著減少，而添加ORF表達后這些改變恢復到對照水平，但Mut組沒有恢復。這表明RBRP 肽可以促進腫瘤發生，但LINC00266-1本身并不促進（圖a-d）。細胞功能實驗做完后，研究者在動物體內實驗進一步驗證，結果與細胞實驗相符，即恢復組促進癌細胞增長，而Mut組沒有變化（圖e-g）。總的來講，研究者發現由LncRNA LINC00266-1編碼產生的RBRP肽有致癌作用（不是LINC00266-1本身），并且RBRP在體外和體內均能促進腫瘤的發生和轉移。

深入挖掘

研究者進一步探究RBRP是如何影響下游靶蛋白而導致癌癥的發生。利用Co-IP拉下與其相互結合的蛋白并進行質譜分析，發現目標蛋白IGF2BP1。雙向Co-IP證明RBRP和IGF2BP1的相互結合關系。首先用RNaseA酶排除RNA中間體的關系，再用截斷式Co-IP發現RBRP結合于IGF2BP1 KH3-4雙結構域（圖a-f）。先前的研究報道，KH3-4雙結構域中的GxxG基序對于m6A的識別和結合是必不可少的。所以研究者在KH3-4雙結構域中將GxxG突變為GEEG，可完全消除RBRP與IGF2BP1的相互作用。接下來研究了RBRP與IGF2BP1結合的結構域，結果發現G19而非A的G19 突變破壞了RBRP與IGF2BP1的結合（圖i，j），這表明RBRP中的G19殘基對于IGF2BP1結合是必不可少的。綜合分析，RBRP 可綁定到RNA m6A閱讀蛋白IGF2BP1上。

那到底是RBRP還是LINC00266-1增加了IGF2BP1對m6A的修飾？之前有研究表明IGF2BP1通過與編碼區不穩定決定因子（CRD）結合穩定c-Myc mRNA，所以研究者以c-Myc CRD為檢測標準，通過RNA pulldown、RIP-QPCR、Dot blot實驗對比LINC00266-1 NC/ORF/MT組，驗證了RBRP增加了IGF2BP1與m6A修飾的c-Myc mRNA CRD的結合（圖a-c）。進一步研究發現，G19A突變體沒有增加內源性IGF2BP1與m6A甲基化的c-Myc mRNA CRD的結合，這些結果表明：RBRP通過其G19殘基增加IGF2BP1與m6A修飾的c-Myc mRNA CRD的結合（圖d-g）。同時RIP-qPCR實驗表明，當沉默m6A寫入蛋白METTL14的表達，細胞內RNA m6A水平降低時，RBRP過表達誘導的內源性IGF2BP1與c-Myc mRNA CRD結合的增強顯著受損，說明RBRP不會增加IGF2BP1對m6A修飾的c-Myc mRNA CRD突變體的識別（圖h-i）。所以，RBRP（不是LINC00266-1本身）增強了m6A的識別和m6A閱讀蛋白IGF2BP1在RNA上的結合。

研究者接下來通過比較c-Myc mRNA的穩定性，再次排除LINC00266-1的干擾，證明是RBRP增加了c-Myc mRNA的穩定性，以及c-Myc mRNA和蛋白水平（圖a-c）。IGF2BP1的干擾阻斷了RBRP過表達引起的c-Myc mRNA穩定性增強（圖d）。敲低METTL14后發現，RBRP過表達對c-Myc mRNA穩定性的增強作用被消除，而c-Myc mRNA CRD突變顯著消除RBRP過表達引起的c-Myc mRNA穩定性增強和c-Myc mRNA和蛋白水平升高。這些結果表明RBRP以c-Myc mRNA CRD?m6A依賴的方式增加c-Myc mRNA的穩定性（圖e-h）。隨后又通過對臨床樣本的檢測，發現c-Myc水平與RBRP 致癌肽水平呈正相關（圖i-j）。綜上研究說明，RBRP通過加強IGF2BP1對c-Myc mRNA CRD的m6A識別，從而提高c-Myc mRNA的穩定性。

結果

研究者發現LncRNA LINC00266-1實際上編碼了一種未標記的肽（RBRP），該肽在腫瘤發生過程中具有致癌作用。接下來發現RBRP可以與m6A閱讀蛋白IGF2BP1結合使 mRNA 更加穩定。最后發現通過RBRP與IGF2BP1的結合，增強IGF2BP1對RNA的識別作用，通過增加c-Myc mRNA的穩定性和表達，從而促進腫瘤發生。