The m6A-Related Long Noncoding RNA Signature Predicts Prognosis and Indicates Tumor Immune Infiltration in Ovarian Cancer

m6A相關(guān)的長非編碼RNA特征可預(yù)測預(yù)后并顯示卵巢癌的腫瘤免疫浸潤情況

發(fā)表期刊：Cancers (Basel)

發(fā)表日期：2022 Aug 22

影響因子：6.575

DOI:? 10.3390/cancers14164056

一、研究背景

????????卵巢癌是一種婦科惡性腫瘤，OV是這種癌癥的常見類型，在所有卵巢癌患者中，OV的發(fā)生率為百分之九十。隨機(jī)試驗(yàn)的結(jié)果顯示，經(jīng)陰道超聲和CA-125檢測對(duì)診斷卵巢癌和改變死亡率的幫助不大。人們更加關(guān)注發(fā)現(xiàn)參與癌癥發(fā)病和進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控基因并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建預(yù)后特征。

????????最近，作為各種RNA的可逆表觀遺傳修飾，m6A RNA修飾在癌癥發(fā)病機(jī)制、藥物反應(yīng)和開發(fā)新的治療靶點(diǎn)中的重要作用和分子機(jī)制得到了深入的研究和證實(shí)。LncRNA是一組RNA分子。雖然lncRNA不能翻譯成蛋白質(zhì)，但它對(duì)許多生物過程，如腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有重要影響。m6A和lncRNAs之間的關(guān)系正在深入研究中。廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs的生物生成和功能取決于m6A的修飾。

二、材料與方法

1、數(shù)據(jù)來源

1） 從TCGA數(shù)據(jù)集（374個(gè)樣本）和GSE9891（278個(gè)樣本）收集OV樣本的基因表達(dá)譜和臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)

2） 不同階段的OV樣本的單基因表達(dá)來自GEPIA

3） 為了確定四個(gè)mRLs在更多癌癥中的作用，從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫獲得了33種癌癥的泛癌癥數(shù)據(jù)，包括RNA-seq、免疫亞型、預(yù)后概況和干性評(píng)分

4） OV和正常樣本

2、分析流程

流程圖

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

01 - 在OV患者中建立并驗(yàn)證基于mRLs的預(yù)后特征

? ? ? ? 首先從TCGA-OV數(shù)據(jù)集中提取lncRNAs的表達(dá)，并通過Pearson相關(guān)性分析確定了419個(gè)mRLs與m6A調(diào)控因子的關(guān)系。圖1b顯示了m6A調(diào)控因子和mRLs之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。在收集了GSE9891數(shù)據(jù)集中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)有61個(gè)mRLs在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中共同存在。通過TCGA-train的單變量回歸分析，篩選出5個(gè)與預(yù)后有關(guān)的mRLs。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)集中m6A調(diào)節(jié)因子和lncRNAs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

????????將374名OV患者按1：1的比例隨機(jī)分為訓(xùn)練集和測試集，在訓(xùn)練集中進(jìn)行LASSO和多變量回歸分析，以建立可靠的預(yù)后特征。公式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（-0.068088177 * expr（WAC-AS1））+（-0.276777737 * expr（LINC00997））+ (0.09155959 * expr (DNM3OS)) + (-0.137781856 * (FOXN3-AS1))，expr指表達(dá)值。WAC-AS1、LINC00997、DNM3OS和FOXN3-AS1最終被確定為關(guān)鍵的mRLs。GEPIA數(shù)據(jù)集的表達(dá)分析結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果都表明，DNM3OS和FOXN3-AS1在正常組織中的表達(dá)量高于腫瘤組織。

????????作者評(píng)估了TCGA訓(xùn)練集中OV患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并將其分為兩組。圖2顯示了TCGA訓(xùn)練集中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的分布、每個(gè)樣本的生存狀態(tài)（圖2a）和關(guān)鍵基因表達(dá)模式的熱圖（圖2e）。與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存預(yù)后很差（圖2i）。基于簽名的時(shí)間依賴性接收操作特征曲線（ROC）分析顯示，1年、2年和3年生存率的AUC分別為0.624、0.694和0.630（圖2m）。為了驗(yàn)證mRL預(yù)后特征，計(jì)算了TCGA-測試集（N = 187）、TCGA-整體（N = 374）和GEO數(shù)據(jù)集（N = 278）中患者的風(fēng)險(xiǎn)得分，并根據(jù)TCGA-訓(xùn)練集的中位風(fēng)險(xiǎn)得分將患者分組（圖2b-d）。除DNM3OS外，WAC-AS1、LINC0099和FOXN3-AS1的表達(dá)在低風(fēng)險(xiǎn)組中更高（圖2-h）。對(duì)TCGA測試集、TCGA整體和GEO數(shù)據(jù)集的Kaplan-Meier分析顯示了同樣的趨勢，即低風(fēng)險(xiǎn)的OV患者的OS高于高風(fēng)險(xiǎn)組（圖2j-l）。此外，隨時(shí)間變化的ROC曲線強(qiáng)調(diào)了基于mRLs的預(yù)后特征的能力。圖2n-p顯示了三組中1年、2年和3年生存率的AUC。這些結(jié)果都證明了mRL預(yù)后特征在OV預(yù)測中的準(zhǔn)確性和可靠性。

圖2 mRL預(yù)后特征的構(gòu)建和驗(yàn)證

02 - 模型與臨床因素之間的關(guān)系

????????圖S4a-f中進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床特征之間的關(guān)聯(lián)。年齡≤60歲組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分低于年齡>60歲組（圖S4d），高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的老年患者比例為52%，而低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的人群為40%（圖S4a）。然而，按腫瘤等級(jí)和腫瘤分期分配的組別中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的差異并不顯著（圖S4b-c,e-f）。此外，高免疫分值組的風(fēng)險(xiǎn)得分明顯高于低分值患者（圖S4g），在群組1和群組2亞組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中也可發(fā)現(xiàn)明顯差異（圖S4h）。按患者年齡、腫瘤等級(jí)和腫瘤分期分組的分層分析突出表明，高危組患者的OS比低危組差（圖S4i-n）。在比較各組患者的狀態(tài)時(shí)，還發(fā)現(xiàn)高危組患者的死亡率較高，而且死亡患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于活著的患者。接受化療的患者OS的K-M曲線顯示，高風(fēng)險(xiǎn)的患者比低風(fēng)險(xiǎn)的患者預(yù)后更差。在BRCA1患者中，低風(fēng)險(xiǎn)組也有良好的生存結(jié)果。

圖S4 與TCGA訓(xùn)練集中的臨床病理特征相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)

????????在TCGA-train、TCGA-test、TCGA-entire和GEO數(shù)據(jù)集中進(jìn)行的單變量和多變量回歸分析均表明mRL模型的獨(dú)立性。此外，患者年齡和腫瘤分期也是OV的關(guān)鍵不良預(yù)后因素。為了預(yù)測簽名的性能，作者在TCGA（圖3a）和GEO數(shù)據(jù)集中建立了一個(gè)包括風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)、年齡、等級(jí)和階段的nomogram。圖3b-d顯示，OS的預(yù)測率與觀察到的比率高度一致。此外，與其他臨床特征相比，預(yù)后特征顯示出卓越的預(yù)測能力，當(dāng)與臨床特征相結(jié)合時(shí)，該模型顯示出比單獨(dú)使用特征時(shí)更好的預(yù)測能力（圖3e）。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)集中OV患者的nomogram

03 - mRL預(yù)后特征和TME之間的關(guān)聯(lián)性

????????GSEA表明，與免疫有關(guān)的通路在高危人群中富集（圖4a，b）。首先，作者使用ESTIMATE算法，表明高危人群的基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分都比較高，而且風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與它們有正相關(guān)（圖4c-h）。在GEO數(shù)據(jù)集中也發(fā)現(xiàn)了同樣的趨勢（圖4i-n）。

圖4 在TCGA數(shù)據(jù)集中，風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)和免疫特征之間的關(guān)聯(lián)性

????????然后，通過比較各組之間的22個(gè)腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（TIICs），作者發(fā)現(xiàn)在TCGA數(shù)據(jù)集中，靜止的樹突狀細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)，T濾泡輔助細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的浸潤水平與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（圖5a-i）。在GEO數(shù)據(jù)集中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與γδT細(xì)胞和靜止記憶CD4 T細(xì)胞呈正相關(guān)，而風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與Tregs、靜止NK細(xì)胞和活化樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。各組之間免疫評(píng)分和TIICs豐度的差異表明，高風(fēng)險(xiǎn)患者具有壓抑的免疫表型，這可以部分解釋高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分者的OS較差。

圖5 TCGA數(shù)據(jù)集中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系以及mRLs在腫瘤微環(huán)境中的作用

????????為了確定四個(gè)mRLs的免疫學(xué)作用，用CIBERSORT算法評(píng)估了它們與TIICs的關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)DNM3OS與T濾泡輔助細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和記憶B細(xì)胞有明顯的關(guān)聯(lián)；WAC-AS1與T濾泡輔助細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞有關(guān)聯(lián)（圖S8a）。此外，WAC-AS1和LINC00997與免疫評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，而DNM3OS和FOXNS-AS1與免疫評(píng)分正相關(guān)（圖S8b）。接下來，為了探索lncRNAs在腫瘤進(jìn)展中的潛在機(jī)制，作者使用GSEA分析來建立OV中mRLs的富集途徑（圖S8c-f）。發(fā)現(xiàn)DNM3OS在鈣信號(hào)通路、焦點(diǎn)粘附通路、造血細(xì)胞系通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路和癌癥通路中高度富集。

圖S8 m6A相關(guān)lncRNAs的表達(dá)與免疫特征的關(guān)系

????????腫瘤組織中PD-L2的表達(dá)水平高于正常組織（圖6a），而且在TCGA和GEO數(shù)據(jù)集中，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的表達(dá)水平明顯更高（圖6c-f），這表明高風(fēng)險(xiǎn)組從免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）中獲益較少。此外，LINC00997顯示出與PD-L2高度相關(guān)（圖6b）；因此，LINC00997在腫瘤免疫微環(huán)境中的功能值得進(jìn)一步研究。比較各組之間的免疫表型（IPSs），低風(fēng)險(xiǎn)組的IPSs明顯較高，表明其免疫原性表型更強(qiáng)（圖6g-j）。這些結(jié)果都表明，該簽名可以預(yù)測OV患者的免疫療法的療效。

圖6 IPSs和免疫療法的基因表達(dá)分析

04 - 與OV預(yù)后和TME相關(guān)的mRLs的共識(shí)聚類

????????經(jīng)過共識(shí)聚類，TCGA數(shù)據(jù)集中的OV患者根據(jù)重要的預(yù)后mRLs的表達(dá)情況被劃分為群組1和群組2（圖7a-d）。圖7e中進(jìn)行了群組1和群組2之間表達(dá)模式的熱圖。此外，群組2中的基質(zhì)、免疫和ESTIMATE評(píng)分明顯較高，腫瘤純度大幅降低（圖7g-j）。此外，群組1亞組的幼稚B細(xì)胞、T細(xì)胞激活記憶CD4細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和靜止肥大細(xì)胞的浸潤更高，而M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在群組2亞組中較高（圖7f）；因此，群組2更傾向于表現(xiàn)為免疫抑制表型。Kaplan-Meier分析的結(jié)果強(qiáng)調(diào)，群組2的OS明顯比群組1差（圖7k），而且群組2的PD-L2表達(dá)量更高（圖7l）；這表明群組2的患者可能對(duì)免疫治療反應(yīng)更敏感。上述結(jié)果都表明，mRLs的表達(dá)影響著TME，導(dǎo)致不同的預(yù)后。

圖7 OV共識(shí)聚類亞群的預(yù)后和免疫浸潤情況

05 - 泛癌中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)和免疫狀態(tài)

????????作者利用TCGA的33種癌癥的泛癌數(shù)據(jù)，進(jìn)一步研究四種mRLs與泛癌中的免疫特征、干細(xì)胞特性和患者預(yù)后之間的關(guān)系。33種癌癥中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)模式（圖8a-d）顯示了腫瘤間的異質(zhì)性，但在大多數(shù)癌癥中，WAC-AS1的表達(dá)水平在腫瘤組織中較高，而DNM3OS的表達(dá)水平則相反，這與OV的表達(dá)趨勢一致。四種mRLs在所有33種癌癥類型中的表達(dá)分布與上述結(jié)果呈現(xiàn)相同的趨勢（圖8e）。此外，關(guān)鍵mRLs之間沒有明顯的相關(guān)性。Kaplan-Meier分析和單變量回歸分析顯示，mRLs在不同癌癥患者的生存中的作用各不相同。

圖8 泛癌癥mRLs的表達(dá)

????????為了確定泛癌中關(guān)鍵mRLs和免疫特征之間的關(guān)系，作者調(diào)查了免疫亞型以及與基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分、基于DNA甲基化的干性評(píng)分（DNAss）和基于mRNA的干性評(píng)分（RNAss）的相關(guān)情況。通過對(duì)泛癌的廣泛免疫基因組分析，根據(jù)免疫、遺傳和臨床特征的差異，確定了六種免疫亞型，包括傷口愈合型（C1）、IFN-γ主導(dǎo)型（C2）、炎癥型（C3）、淋巴細(xì)胞耗竭型（C4）、免疫安靜型（C5）和TGF-β主導(dǎo)型（C6），其中C3的OS很好，C2和C1的預(yù)后差，而C4和C6的預(yù)后最差。作者評(píng)估了mRL表達(dá)水平與六種免疫亞型之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們都與泛癌免疫亞型有關(guān)，并且C1、C2和C6亞型的DNM3OS表達(dá)量升高（圖9a）。此外，DNM3OS與基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分呈正相關(guān)，而WAC-AS1和LINC00997與基質(zhì)和免疫評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（圖9b-d），這在OV中表現(xiàn)出類似的相關(guān)性。所有四個(gè)mRLs都與RNAss呈負(fù)相關(guān)（圖9e）。因此，這四個(gè)mRLs參與了特定TIME的形成。最后，應(yīng)用CellMiner數(shù)據(jù)庫來評(píng)估m(xù)RLs和藥物敏感性之間的相關(guān)性。z-score越高意味著對(duì)一種特定藥物的敏感性越高。顯著的是，F(xiàn)OXNS-AS1的表達(dá)影響了各種細(xì)胞系的藥物敏感性。

圖9 泛癌癥中mRLs的表達(dá)與免疫亞型、腫瘤微環(huán)境和癌癥干性的關(guān)系

四、結(jié)論

????????總之，本研究建立了一個(gè)獨(dú)立而可靠的mRLs預(yù)測特征，并系統(tǒng)地評(píng)估了其預(yù)測的準(zhǔn)確性和在TIME中的作用。共識(shí)聚類分析和泛癌分析證明了特定的mRLs在不同癌癥類型中的重要作用，這可能有助于發(fā)現(xiàn)OV的新型治療靶點(diǎn)。