Western Blot（WB），蛋白免疫印跡法，一句話，定性、定量檢測蛋白表達的一種經典、有效的技術方法。

將電泳分離的細胞或組織蛋白轉移到PVDF膜上，用特定抗體結合蛋白抗原，再結合標記的二抗，以化學發光的方式可視化地將蛋白表達情況呈現在人們面前，是幾乎每一位生物汪或科研汪的“必懷利器”。Western Blot的Protocol那么多，然鵝，沒有一款是適合你自己的。辛辛苦苦做了兩天，還不包括前期的細胞培養、蛋白提取等等，顯影結果一現，立馬想哭暈在廁所，我的小心臟啊......

我也經歷了不分晝夜的虐心歷程，為了得到一條滿意的條帶，潛心做Western Blot一月余，有時在暗室（浸泡在老鼠味兒和飼料味兒中）一連曝光兩個小時，出來后連午飯都不想吃了，終于，終于，終于，喜極而泣啊！

先上幾幅我做的Western Blot結果：

引用一位師兄的話：“跑的Western跟磚一樣”。現將個人做Western的心得體會分享給大家。

實驗虐我千百遍，我待實驗如初戀

言歸正傳，做好Western需要注意各種細節。工欲善其事，必先利其器，首先還是從蛋白提取開始談起。

壹：蛋白提取

一、細胞蛋白的提取

1.收樣前3min先配制細胞裂解液（現配現用），RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，計算用量。以收集六孔蛋白為例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制劑12ul，磷酸酶抑制劑12ul，混勻后置于冰上。（我使用的試劑RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制劑混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）均購自康為世紀公司）

2.棄掉舊的培養基，PBS洗三遍。

3.每孔加入200ul剛配好的裂解液，立即置于冰上，在搖床上裂解30min。

4. 30min后在冰上將6孔板中的細胞收集至EP管中（盡可能多地刮掉細胞）。

5. 14000g，15min（4℃）離心，取上清于EP管中即為提取的蛋白（最好用進口Axygen EP管，后文解釋原因）。

注：2~4步也可先用胰酶收集細胞，離心，PBS洗三次，再向EP管中加入裂解液，置于冰上搖床裂解30min。我也嘗試過這種方法，相比而言，上一種方法簡便并節約時間，但可能會損失一些細胞，可根據實際情況選擇。

二、組織蛋白的提取

（全程在冰上操作）

1.將動物組織（腦、肺等）取出后分裝成三份或更多（一份WB，一份qPCR，一份備用），取出后立即存于-80℃。（注：取完一塊組織后立即凍存于-80℃，反復凍存樣品對待測蛋白有影響，最好用新鮮樣品實驗）

2.配制細胞裂解液（現配現用），組織:RIPA=1mg:10ul，可根據實際情況調整。RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。配好后置于冰上。

3.將其中一份組織剪下約90mg于有鋼珠的震蕩勻漿器中勻漿。此勻漿器的蓋子或芯通常置于-20℃，使用時取出，操作應快捷，勻漿1min基本可保持溫度。

4.將勻漿加入90ul現配的裂解液中，冰上搖床裂解30min。

5. 14000g，15min（4℃）離心，取上清于Axygen EP管中即為提取的蛋白。

貳：蛋白濃度測定

我采用的是康為世紀公司的BCA蛋白定量試劑盒測定提取蛋白濃度，和說明書protocol差別不大，稍有不同，如下：

1.稀釋BSA標準品以制作標準曲線：取7支EP管，每管加30ul生理鹽水，第一管加30ulBSA，混勻后再取30ul至第二管，依次倍比稀釋，最后一管不加為空白（即本底值）。則8個標準品的濃度分別為2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。

2. 5倍稀釋樣品蛋白：取六支EP管（6個樣品），各管加40ul NS，再分別取10ul樣品在各管中稀釋。

3.將8個標準品和稀釋待測樣品各加25ul于96孔板中。

4.配制BCA工作液：每個樣品做2個重復，再加上8個標準品，一共20個孔，按22個孔算，以防加樣損失。則需A液：200ul×22=4400ul，B液：4400ul/50=88ul，計算好所需體積后在一干凈試管中將A、B工作液混勻。

6.混勻后立即向各孔中加入200ul配制的BCA工作液，37℃孵育30min。

7.酶標儀562nm下測定各樣品和BSA標準品的吸光度值，作出標準曲線，計算出待測樣品的濃度。

8.根據各樣品濃度計算1×loading buffer體積，將各樣品濃度調為一致；并計算5×loading buffer的體積，加入各管中。混勻后沸水煮15min，冰上分裝，存于-20℃。

Tips

1.前面提到收集蛋白于進口Axygen EP管中，是為了防止煮沸蛋白時EP管蓋子彈開，液體濺出而改變蛋白濃度。

2.關于分裝體積，我提取的細胞蛋白調整濃度后約為1.5ug/ul，每次電泳上樣20ul，所以分裝體積每管50ul，一次或兩次電泳即可用完，避免反復凍融。

叁：Western Blot

一、WB所需試劑

可提前配制：

1. 10×電泳緩沖液：

配制250ml 10×電泳液作為母液，依次稱取Tris 7.5g，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加雙蒸水至250ml，常溫保存。使用時用蒸餾水稀釋至1×。

2. 1×電轉液：

配制500ml 1×電泳液，依次稱取Tris 2.9g，甘氨酸1.45g，SDS 0.185g，加雙蒸水400ml，待都溶解后再加入100ml甲醇，常溫保存。

配制的電泳液和電轉液可供多次Western使用。

注意：1.最后加入甲醇，若先加甲醇，Tris、甘氨酸和SDS不易溶解。

2.溶解較慢時可用磁力攪拌器加快溶解。

現配現用：

分離膠、濃縮膠、5% BSA溶液(w/v)、5%牛奶(w/v)、1×TBST洗液、一抗和二抗，在WB步驟中詳細介紹。

二、WB protocol

（一）清洗玻板和小燒杯：

戴好口罩和手套，選用1.0mm玻板，用試管刷和洗潔精仔細刷洗玻板，清水沖洗干凈。卡槽對齊卡好后置于軟橡膠墊片上，夾緊，向板中加滿蒸餾水試板子是否漏液。觀察幾分鐘后若不漏液，將板子中水倒出，倒扣晾干。

（二）配膠：

1.配制8ml 10%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml，1.5M?pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混勻后立即灌膠，用1ml槍頭沿著玻板上沿從左至右輕輕將膠打入，以免膠濃度不均勻，避免氣泡產生。加完后換200ml槍頭從左至右更加小心加入蒸餾水水封，以免沖散剛灌的分離膠。靜置，當水和膠之間出現一條水平的折線時，即已凝固。

2.待分離膠凝固后，將水封的蒸餾水倒出，可將濾紙條放于玻板角吸水加快殘留水流出，倒置。配制4ml 5%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M?pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混勻后立即灌膠，同上用1ml槍頭從左至右輕輕加入濃縮膠，加滿后沖洗10孔梳子，水平輕輕插入濃縮膠中靜置待其凝固。可將剩余的濃縮膠沿著梳子加入玻板中以完全密封。

3.此時，可將之前分裝好的煮過的加入loading buffer的蛋白樣品、預染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。

Little Trick

1.AP和TEMED均為神經毒性、致癌物質，使用時需小心。

2.灌膠時視線與膠面水平，注意操作，避免膠濺入眼睛中。

在一個月黑風高的夜晚，北京時間22:00，我獨自一人在空蕩蕩的實驗室中配膠，剛好使用了一個槍頭口有問題的1ml藍槍頭。說時遲那時快，濃縮膠從槍頭口的小洞倏地噴到了我的眼睛中。我立即脫掉手套，洗干凈手，用大量清水沖洗眼睛，禱告眼睛別出什么問題。從此以后，每次灌膠我都戴上眼鏡。

3.常溫下半小時膠可凝固，若天氣寒冷或需加快凝固，可將其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固。

4.若第二天早上立即跑膠，這樣就不耽誤午飯時間，可頭天晚上先把膠配好，凝固后取下玻板，連夾子、梳子一同放入蒸餾水中，4℃過夜保存。

（三）電泳：

1.將玻板卡緊電泳槽中，先在內槽加滿已配好的1×電轉液，十幾分鐘后觀察是否漏液，若漏液重新調整玻板，再次卡緊，直至不漏液為止。否則，可能膠還沒跑完，電轉液就漏完了。

2.輕輕拔去梳子，第一孔加入5ul預染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待測蛋白樣品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上樣時輕輕加入，注意不要將樣品加入其他孔，或加樣過快導致樣品溢出。

3.插好正負極，注意檢查正負極不能插反。調節電壓至80V（濃縮膠），跑0.5h后；將電壓調至100V（分離膠），約1.5h后，maker分離明顯，在膠底部出現一條藍色的buffer條帶，此時電泳完畢。使用完在實驗儀器使用本上做好登記。

注意：避免藍色條帶跑出分離膠，這樣有可能目的蛋白也已經跑出，所以在分離膠底部出現一條整齊水平的藍色條帶時，即停止電泳。

Little Trick

1.電泳時插好正負極后，從電泳槽底會有小氣泡上升，氣泡的數目和上升速率與電壓大小呈正比。若小氣泡和往常不太一樣，觀察幾分鐘后還是如此，則需檢查是否加錯了電泳液，或者電泳液配制有誤。

2.一般濃縮膠80V 0.5h，分離膠100~120V 1~1.5h，具體跑膠電壓和時間與目的蛋白大小、實驗儀器和實驗室環境都有關，需多次探索最佳條件。若目的蛋白較小，則盡量縮短跑膠時間，并及時觀察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分別實驗了濃縮膠80V 0.5h，80V 1h，分離膠120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，結果顯示在本實驗室實驗儀器下，我的目的蛋白及內參在濃縮膠80V 0.5h，分離膠100V 1.5h條件下，分離效果最好。在此條件下，我做了幾次重復實驗，結果均一致。因此，總結出本實驗室此目的蛋白的最佳電泳條件。

3.電泳的好壞直接影響到目的蛋白的顯影情況，尤其時磷酸化目的蛋白的二聚體，若電泳條件優化，結果可清晰顯出蛋白表達情況。所以探索最佳電泳條件是決定勝負關鍵一步。

4.電泳快結束時即可準備轉膜所需的濾紙和PVDF膜，浸泡在電轉液中。建議在第一次WB后分別剪好不同大小的硬紙片，標好面積和孔數（即樣品數），存好以后隨時使用。

5.WB中夾取PVDF膜最好使用平頭鑷子，并夾住膜左上角，可最大程度減小對膜上蛋白的損害。

（四）切膠：

電泳結束后，取出玻璃板，稍微沖洗，洗凈電泳槽，放好。輕輕撬開玻璃板，根據maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切膠，為了防止切歪，可在玻璃板下墊上上述剪好的同切膠大小一致的硬紙片。一般一塊膠需切下目的蛋白和內參兩小塊膠，將切下的膠分別浸泡在電轉液中。

（五）轉膜：

1.根據每一塊切膠的大小剪6張同樣大小的濾紙和一張PVDF膜，浸泡于電轉液中，可以提前準備好的硬紙片為模板剪。PVDF膜先經甲醇活化20s后浸泡于電轉液中。

2.在電轉儀上制作“三明治”結構轉移膜，最下面放三層濾紙，然后依次放PVDF膜，膠，三層濾紙，用玻璃棒輕輕趕走氣泡（注意上下三層濾紙之間不能接觸，否則易造成短路）。蓋上蓋子，根據膜的總面積調整電流，電轉2h。

3.在電轉的同時，可以配制以下液體，事先根據膜的數量計算好所需體積：

以一塊膜為例，封閉5ml+稀釋一抗4ml+稀釋二抗4ml，需要13ml，則配制15ml。

5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，稱取0.75g BSA晶體，溶于15mlTBST中，漩渦振蕩器混勻，現用現配，4℃保存（若目的蛋白為磷酸化蛋白時配制）。

5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)，稱取0.75g脫脂奶粉，溶于15ml TBST中，漩渦振蕩器混勻，現用現配，4℃保存。

1×TBST洗液：使用時將100×TBST用雙蒸水稀釋至1×，常溫保存。

Little Trick

1.關于電轉膜，有些使用NC膜。我沒有嘗試過NC膜，但隔壁實驗室使用NC膜多次WB結果仍不理想，換用PVDF膜后有所改善。因此建議還是使用PVDF膜，可購買Millipore的PVDF膜，一卷有些貴，但是可以夠一個實驗室用好幾年哪。最好不要在經銷商購買分裝的的PVDF膜，另一實驗室一同學想著價格便宜也就只做幾次，就從試劑公司只買了100cm2的膜，結果這價格虛高不說，而且膜還是假的，直到做完實驗了才發現，蛋白樣品也浪費了。所以建議還是購買Millipore公司原裝的PVDF膜。

2.關于電轉方式，有些采用濕轉，有些采用半干轉，兩種方式均可。個人覺得半干轉方便簡捷些。

（六）封閉：

1.電轉結束后，根據maker位置和目的蛋白及內參大小剪膜。可在標有maker的一邊左上角剪一個小角，以清楚哪一條帶是1號樣品。

2.分別用已配好的5% BSA和5%牛奶封閉目的蛋白和內參，室溫搖床上孵育2h。根據盒子大小，加入封閉液的量需沒過膜。

（七）孵育一抗：

1.配制p-STAT1一抗（SAB公司），1:500稀釋，加入上述配制的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混勻，現配現用。

配制actin一抗（康為世紀公司），1:2000稀釋，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混勻，現配現用。

2.將PVDF膜從封閉液中取出，可用平頭鑷子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃過夜。我一般用封口膜做成小盒，置于大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用槍從上到下向膜上加一抗，完全浸沒，之后和PCR上樣儀一同固定在搖床上，4℃孵育過夜。

（八）次日，回收一抗，做好標記，-20℃保存，可再使用3~4次。將膜放入1×TBST中，搖床上清洗三次，每次10min。

（九）孵育二抗：

1.配制具有種屬特異性的HRP標記的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀釋，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混勻，現配現用。

2.TBST洗完膜后，加入二抗，室溫搖床上孵育2h。

（十）顯影：

1.二抗孵育完后，回收，-20℃保存。1×TBST搖床上洗膜三次，每次10min。

2.一條目的蛋白即一張膜需要100ul發光液A和100ul發光液B，根據膜數計算用量，提前4℃混合好發光液A和B。

3.到暗室中加混合好的發光液，在膠片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光膠片，可分別不同時長曝光，如15s，30s，1min，5min等，然后在顯影液和定影液中顯影，放入自來水中。出暗室后，將膠片掛起晾干。

也可用Bio-rad凝膠成像系統照相，選擇不同的曝光時間成像。

Little Trick1.需通過不同曝光時間探索某蛋白最佳曝光時間，多次重復實驗即可采用此曝光時長。我最開始也是在暗室中顯影，后來用Bio-rad凝膠成像系統照相，對比結果發現后者的結果更加清晰明顯，背景也更加干凈，之后就一直用成像儀曝光照相了。

2.夾取膠片可用普通鑷子，但也只夾膠片左上角，避免損害膠片上曝光的蛋白條帶。

3.膠片左上角maker一側一定要剪一小角或做其它標記，才可在顯影后明顯對應各個樣品。

4.若暗室曝光，可能內參蛋白發光液剛加上就出現很亮的條帶，這時最長曝光15s已經足夠。

（十）膜重生：

若顯影效果不好，可將膜重生，再次顯影，省去了配膠、電泳和電轉等步驟。

1.加4ml蛋白印跡膜再生液，室溫搖床30min。

2. 1×TBST洗3次，每次10min。

3.5% BSA或5%牛奶封閉2h。

4.一抗4℃孵育過夜。

5.次日1×TBST洗三次，每次10min。

6.二抗孵育2h。

7.1×TBST洗三次，每次10min，曝光成像。

（本實驗室使用的100×TBST、二抗和白印跡膜再生液均購自康為世紀公司）

但是我實驗幾次膜重生后的結果并不理想，所以還是乖乖從頭開始做WB。

Western Blot只是眾多科研技術方法中的滄海一粟，只要肯探索，肯總結，終會守得云開見月明。

真理本身就是不斷探索、不斷重復的過程。

科研也就是一件幸福有意思的事，不是嗎？

最后

祝愿大家

都能跑出漂亮的條帶

都能擁有自己的“個性化Protocol”

都能年年發paper

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