王炸組合『?jiǎn)渭?xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組』的科研應(yīng)用【1】：心血管發(fā)育/疾病

02?肝臟生理學(xué)/疾病

最近的技術(shù)進(jìn)步使得在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行全基因組RNA分析成為可能，這種技術(shù)被稱為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）。肝臟組織的scRNA-seq主要包括肝臟組織被解離，單細(xì)胞被捕獲，RNA測(cè)序等工作流程。

scRNA-seq工作流程的主要步驟和最常用技術(shù)的比較

使用scRNA-seq研究肝臟病理生理學(xué)

單細(xì)胞水平的肝臟生理學(xué)研究

> 從單細(xì)胞數(shù)據(jù)中收集空間信息來研究肝臟的分區(qū)情況

scRNA-seq最早的應(yīng)用之一是研究小鼠和人類的肝臟分區(qū)。使用scRNA-seq研究肝臟生理學(xué)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是單個(gè)細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)與空間信息的整合。為了克服這一障礙，已經(jīng)開發(fā)了特定的測(cè)序策略和生物信息學(xué)分析方法，使人們對(duì)肝臟分區(qū)有了新的認(rèn)識(shí)。在相關(guān)研究中，研究人員通過結(jié)合scRNA-seq和單分子RNA熒光原位雜交（smRNA-FISH）來進(jìn)行空間分辨率的RNA測(cè)序，研究了小鼠肝臟分區(qū)。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和將scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間信息相匹配的策略

一旦已知某一細(xì)胞類型的空間轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，成對(duì)細(xì)胞測(cè)序可以推斷其他細(xì)胞類型的分區(qū)，并確定細(xì)胞間的強(qiáng)相互作用。當(dāng)表面蛋白可用作空間標(biāo)記時(shí)，利用FACS進(jìn)行空間分類可用于對(duì)特定區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行分類。Combining >?2個(gè)反向分區(qū)標(biāo)記，可以從特定的肝小葉區(qū)域?qū)?xì)胞進(jìn)行分選，不僅有利于scRNA-seq，而且有利于多組學(xué)分析。對(duì)空間分選的肝細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和RNA-seq檢測(cè)，可以繪制蛋白質(zhì)分區(qū)圖譜，以及特定肝區(qū)中基因表達(dá)與蛋白質(zhì)表達(dá)的相關(guān)性。

當(dāng)空間組織是組織異質(zhì)性的主要來源時(shí)，計(jì)算分析也有助于從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷空間信息。例如研究人員應(yīng)用擴(kuò)散偽時(shí)分析來模擬健康人肝臟中肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）的分區(qū)。該計(jì)算分析：1）首次在單基因水平上對(duì)人肝細(xì)胞和LSECs的門中區(qū)劃進(jìn)行了剖析；2）證明LSEC基因具有高度區(qū)劃性；3）證明肝細(xì)胞和LSECs都具有非單調(diào)區(qū)劃模式的基因。超過60%的LSEC基因被發(fā)現(xiàn)是分區(qū)的。

從scRNA-seq研究中得出肝臟分區(qū)的新概念

最近發(fā)展了更復(fù)雜的計(jì)算算法，可以從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷空間信息，例如NovoSpaRc，允許在有或沒有使用已知空間信息和標(biāo)記基因的情況下重新構(gòu)建單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜。

從標(biāo)準(zhǔn)scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷空間信息的挑戰(zhàn)之一是需要通過直接的空間技術(shù)（如免疫組織化學(xué)、免疫熒光或FISH）進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。為了克服這個(gè)問題，最近開發(fā)了原位空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的系統(tǒng)。

原位空間轉(zhuǎn)錄組模型

> 利用scRNA-seq鑒定肝臟發(fā)育和再生過程中的祖細(xì)胞

再生是肝臟生理學(xué)的重要特征之一，但肝膽前體細(xì)胞的確切身份和異質(zhì)性程度尚未完全明確。數(shù)據(jù)主要來源于小鼠模型，根據(jù)損傷模型和實(shí)驗(yàn)背景，提出不同的祖細(xì)胞群（從膽道樣祖細(xì)胞到分化的肝細(xì)胞）是肝臟上皮再生反應(yīng)的主要來源。scRNA-seq有助于研究罕見的細(xì)胞類型，最近被用于研究胎兒和成人肝臟中肝膽前體的異質(zhì)性和信號(hào)通路。目前的多項(xiàng)研究表明scRNA-seq促進(jìn)了在胎兒和正常成人肝臟中發(fā)現(xiàn)EPCAM+區(qū)間的雙能祖細(xì)胞，其激活與YAP靶基因的上調(diào)有關(guān)。為了準(zhǔn)確地描述人類疾病中肝臟再生的驅(qū)動(dòng)因素，需要進(jìn)一步分析專注于慢性和急性損傷后人類肝臟中的祖細(xì)胞群。

通過scRNA-seq發(fā)現(xiàn)正常人肝臟中的雙能祖細(xì)胞

對(duì)慢性肝病和癌癥微環(huán)境的新見解

> 慢性肝病和肝硬化中非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的表型

由肝細(xì)胞和肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPCs）組成的肝臟微環(huán)境在所有慢性肝病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。為了應(yīng)對(duì)慢性肝細(xì)胞損傷，免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子，并激活靜止的肝星狀細(xì)胞（HSCs），這些細(xì)胞成為肌成纖維細(xì)胞，負(fù)責(zé)膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)的積累--這是肝臟纖維化的標(biāo)志。這種肝臟免疫失調(diào)在不同形式的慢性肝病中很常見，并引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激和死亡、細(xì)胞凋亡、肝纖維化以及肝細(xì)胞增殖和肝臟再生。已有單細(xì)胞研究揭示了慢性肝病和肝硬化中NPCs的異質(zhì)性和復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用。

> 肝內(nèi)皮細(xì)胞參與多種細(xì)胞間相互作用以及循環(huán)單核細(xì)胞向肝巨噬細(xì)胞的初次分化

對(duì)健康小鼠和飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）-胰淀素[AMLN]模型小鼠的NPC進(jìn)行單細(xì)胞研究，研究重點(diǎn)為NPC分泌組的特征和細(xì)胞間的相互作用。發(fā)現(xiàn)LSECs可分泌血管分泌因子并表達(dá)多種參與細(xì)胞間相互作用的基因。膽管細(xì)胞、HSCs和LSECs表達(dá)配體，提示與其他NPCs有廣泛的相互作用和自分泌信號(hào)。在NASH肝臟中，LSECs上調(diào)了與脂質(zhì)代謝、趨化因子釋放和抗原呈遞有關(guān)的基因的表達(dá)，而與血管穩(wěn)態(tài)和血管發(fā)育有關(guān)的基因則下調(diào)，誘導(dǎo)了竇狀毛細(xì)血管的顯著破壞。

LSECs是單核細(xì)胞和其他骨髓源性細(xì)胞進(jìn)入肝小葉的入口。LSEC與單核細(xì)胞的相互作用在決定循環(huán)單核細(xì)胞的命運(yùn)以及它們向肝巨噬細(xì)胞的分化中至關(guān)重要。小鼠模型的單細(xì)胞分析表明，在NASH肝臟中，單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞擴(kuò)張，具有獨(dú)特的炎癥表型。是否NASH-LSECs失調(diào)決定了NASH單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞的表型仍然是未知的，需要進(jìn)一步的研究來闡明LSECs與單核細(xì)胞在NASH發(fā)病機(jī)制中的相互作用。

>肝星狀細(xì)胞在空間和功能上呈帶狀分布，是自分泌和旁分泌信號(hào)的中樞

HSCs以前被認(rèn)為代表了一個(gè)功能上同質(zhì)的群體。研究人員利用scRNA-seq對(duì)健康和纖維化小鼠肝臟的肝臟間質(zhì)進(jìn)行解旋，揭示了HSCs在肝小葉的空間分區(qū)。來自小鼠肝臟的scRNA-seq也表明，HSCs特異性分泌細(xì)胞因子，通過分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子作用于LSECs、巨噬細(xì)胞和膽管細(xì)胞，調(diào)節(jié)纖維化途徑、細(xì)胞因子表達(dá)、血管活性激素信號(hào)和HSC凋亡。NASH中HSCs單細(xì)胞分析表明，它們上調(diào)IL-11和細(xì)胞因子，并調(diào)節(jié)LSECs和巨噬細(xì)胞的功能，提示其雙向作用更為復(fù)雜。總之，HSCs的單細(xì)胞分析進(jìn)一步擴(kuò)展了這一概念，即這種細(xì)胞類型在正常和病變肝臟中作為肝臟NPCs旁分泌/自分泌網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐。

>纖維化生態(tài)位中的巨噬細(xì)胞表型和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互作用

在平衡狀態(tài)下，肝臟不斷接觸來自腸道的病原體和毒素；肝臟清除大量的微生物和微生物相關(guān)分子，以維持耐受和免疫抑制的環(huán)境。人類肝臟單細(xì)胞圖譜的數(shù)據(jù)顯示，正常肝臟不僅含有具有代謝和清道夫功能的免疫調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞，還含有促炎巨噬細(xì)胞。scRNA-seq揭示了新的瘢痕相關(guān)的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞亞群，這些亞群存在于肝硬化的纖維化生態(tài)位中；這揭示了這些不同類型的細(xì)胞如何相互作用促進(jìn)纖維化。肝硬化纖維化是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，其特征是處于不同分化和激活狀態(tài)的多種不同細(xì)胞系相互作用。開發(fā)新的抗纖維化治療方法需要考慮纖維化生態(tài)位的復(fù)雜性；治療可能需要同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)治療靶點(diǎn)以達(dá)到抗纖維化的效果。

肝纖維化生態(tài)位中的細(xì)胞間配體-受體相互作用

闡明原發(fā)性肝癌內(nèi)腫瘤微環(huán)境和異質(zhì)性

scRNA-seq有助于描述HCC微環(huán)境中各種細(xì)胞類型的表型，并闡明了癌上皮細(xì)胞和TME之間的相互作用。HCC是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)，包括clonal Tregs、clonal CD8+LAYN+exhausted T 細(xì)胞、pre-exhausted CD8+GZMK+細(xì)胞、LAMP3+DC、骨髓源性抑制細(xì)胞、TAM樣巨噬細(xì)胞和PLVAP+內(nèi)皮細(xì)胞，這些細(xì)胞類似于居住在肝纖維化生態(tài)位的內(nèi)皮細(xì)胞。scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法將有助于我們進(jìn)一步了解TME的細(xì)胞和分子調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而有助于確定肝膽癌的新治療靶點(diǎn)。此外，這些方法還應(yīng)為更精確的腫瘤分類和患者分層提供信息，從而完善該領(lǐng)域的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

利用scRNA-seq研究肝細(xì)胞癌的腫瘤微環(huán)境

scRNA-seq已經(jīng)在對(duì)肝臟分區(qū)、再生以及慢性肝病和癌癥生物學(xué)的理解上有了新的變革性發(fā)現(xiàn)。肝病生物學(xué)涉及多種細(xì)胞類型和復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用，而scRNA-seq可以詳細(xì)研究這些多細(xì)胞的微環(huán)境。目前的挑戰(zhàn)是如何充分利用并將這些新知識(shí)轉(zhuǎn)化為有效的新型治療方法，以解決肝病學(xué)的主要臨床挑戰(zhàn)。

首發(fā)公號(hào)：國(guó)家基因庫(kù)大數(shù)據(jù)平臺(tái)

參考文獻(xiàn)

Saviano A, Henderson N C, Baumert T F. Single-cell genomics and spatial transcriptomics: discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology[J]. Journal of hepatology, 2020.

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