關于GO 注釋的心得體會
目前對于GO功能注釋的思路有 以下常見的四種：
1、BLAST+InterProScan => OmicsBox
可以先通過使用 blastp 進行nr注釋，那么問題就來了，nr 數據庫截至2018年12月已經有120G左右的數據量了，根據我的個人使用經驗，對25000條蛋白進行32線程的并行化比對，差不多要半個月左右（心中一萬匹cnm飄過）。很顯然，在計算資源有限的條件下這是不現實的，那么大概就會出現兩種思路：
（1）縮小數據庫：一種是使用Swiss-Prot等小的數據庫進行注釋；另一種就是根據基于taxid構建 nr子數據庫了，具體的構建可見 基于taxid構建Blast database_bioinfomatics2medicine_新浪博客 （2）能不能使用一個更高效的比對工具呢，答案是肯定的 那就是 GitHub - bbuchfink/diamond: Accelerated BLAST compatible local sequence aligner.
其主頁介紹如下：
DIAMOND is a sequence aligner for protein and translated DNA searches, designed for high performance analysis of big sequence data. The key features are:
Pairwise alignment of proteins and translated DNA at 500x-20,000x speed of BLAST.
Frameshift alignments for long read analysis.
Low resource requirements and suitable for running on standard desktops or laptops.
Various output formats, including BLAST pairwise, tabular and XML, as well as taxonomic classification.
對的，它就是那么快，相對于 blastp 的半個月，在 ‘--more-sensitive’ 模式下也僅需要4-5個小時。
在nr注釋完之后,就到使用 OmicsBox mapping GO id 了。現在所有的服務都要收費了，https://www.biobam.com/omicsbox/#plans. 但價格比以前（Blast2GO）要公道很多, 如果不缺少資金可以購買，但如果不想花錢，那么不如就來個本地化吧，對于本地化網上也有很多的教程了：
blast2go本地化2017教程：blast2go本地化2017教程 - 生信技能樹
非root權限的blast2go的安裝和使用（二）· blast2go的數據和軟件準備及使用：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI1MjU5MjMzNA==&mid=2247486358&idx=1&sn=4b095e9a200a419079d947d930c38abd&chksm=e9e02237de97ab21f4227ee76eca0aa94433fe6cc374e030093eb3acc2094a546110763bb411&mpshare=1&scene=23&srcid=0101kMbzD2el0RPASBiC9pFi#rd
陳連福 centos6.9 代碼：
“# installing Blast2go Databases
mkdir /opt/biosoft/blast2go
cd /opt/biosoft/blast2go
wget http://archive.geneontology.org/latest-full/go_monthly-assocdb-data.gz
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/gene_info.gz ### ascp -k 1 -T -l 200M -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh --host=ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov --user=anonftp --mode=recv /gene/DATA/gene_info.gz 。/
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/gene2accession.gz? #### ascp -k 1 -T -l 200M -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh --host=ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov --user=anonftp --mode=recv /gene/DATA/gene2accession.gz ./
wget ftp://ftp.pir.georgetown.edu/databases/idmapping/idmapping.tb.gz
## 對于不能使用aspera加速下載的文件可以試試 lftp -e 'pget -n NUM -c url; exit'實行多線程下載
gzip -dv go_monthly-assocdb-data.gz
gzip -dv gene_info.gz
gzip -dv gene2accession.gz
gzip -dv idmapping.tb.gz
tar zxf ~/software/local_b2g_db.tar.gz
mv local_b2g_db/* ./? && rm -rf local_b2g_db/
perl -p -i -e 's/go_201512-assocdb-data/go_2017-assocdb-data/' install_blast2goDB.sh
./install_blast2goDB.sh
#一個自己的例子 #
##下載NR 數據庫到自己的Blast+ db 中
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.2.28/ncbi-blast-2.2.28+-x64-linux.tar.gz
tar -zxf ncbi-blast-2.2.28+-x64-linux.tar.gz -C /opt/biosoft/
/opt/biosoft/ncbi-blast-2.2.28+/bin/blastdbcmd -db nr -entry all -out nr.faa
### 值得注意的是這里我用的blastdbcmd是ncbi-blast-2.2.28+的，輸出的 nr.faa 文件中序列名是 “>gi|66816243|ref|XP_642131.1| hypothetical protein DDB_G0277827” ，但如果用的是 ncbi-blast-2.6.0+的 blastdbcmd，輸出沒有GI號，原因可能是：As of September 2016, the integer sequence identifiers known as "GIs" will no longer be included in the GenBank, GenPept, and FASTA formats supported by NCBI for the display of sequence records.In addition, the FASTA format will no longer include the database source abbreviation. Please refer to the NCBI News Announcement posting for more detail.
wget https://github.com/bbuchfink/diamond/releases/download/v0.9.24/diamond-linux64.tar.gz
### 同樣注意版本，因為diamond輸出的XML與 b2g4pipe_v2.5 不兼容而出現 “Annotation of 0 seqs with 0 annots finished. Now searching for orfan IPRs...” 這個issues的討論，你可以在到下面的鏈接去看。
tar -zxf diamond-linux64.tar.gz
mv diamond ~/bin/
cp ../interpro/proteins.fasta ./
ascp -k 1 -T -l 200M -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh --host=ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov --user=anonftp --mode=recv /pub/taxonomy/accession2taxid/prot.accession2taxid.gz ./prot.accession2taxid.gz
ascp -k 1 -T -l 200M -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh --host=ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov --user=anonftp --mode=recv /pub/taxonomy/taxdmp.zip ./
unzip taxdmp.zip
/opt/biosoft/ncbi-blast-2.2.28+/bin/blastdbcmd -db nr -entry all -out nr.faa
diamond makedb --in nr.faa -d nr --taxonmap prot.accession2taxid.gz --taxonnodes nodes.dmp #### DIAMOND v0.9.24
diamond blastp --query proteins.fasta --more-sensitive --db nr --evalue 1e-5 --salltitles --threads 64 --outfmt 5 --out nr.xml
perl -p -e 's/diamond 0.9.24/BLASTP 2.2.26/' nr.xml > nr_new.xml
perl -p -i -e 's/^Dbacces.dbname=.*/Dbacces.dbname=b2gdb/' b2gPipe.properties
perl -p -i -e 's/^Dbacces.dbhost=.*/Dbacces.dbhost=127.0.0.1/' b2gPipe.properties
java -cp *:ext/*: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -in ../nr_new.xml -out go -annot -dat -annex
# 至于整合InterProScan的結果可以使用下面的腳本，當然也可以在java -cp *:ext/*: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -ips 來實現，或者將b2g4pipe的輸出文件加載到 Blast2GO Basic 中進行后續可視化分析。
merge_interpro_to_go.pl b2g4pipe/go.annot ../interpro/interpro.tsv > go.annot
# Anyone use diamond output xml file? for b2gpipe? · Issue #79 · bbuchfink/diamond · GitHub
# diamond to blast2go erro? · Issue #165 · bbuchfink/diamond · GitHub
2、InterProScan
對于 InterProScan 可以本地化，也可以用 interProScan5.pl 將序列發送到官方服務器進行注釋，資源允許，還是推薦本地化，網絡版感覺還是有點慢～一個本地化教程:
3、eggNOG-Mapper （包括網頁版和本地化）
（1）關于這個注釋方法網頁版的推薦自己去摸索吧（就是和NCBI提交類似）=> http://eggnogdb.embl.de/#/app/emapper
（2）本地化推薦兩個教程吧：
序列功能注釋神器：eggNOG-mapper，KEGG/COG/KOG/GO/BiGG 一網打盡 ： 序列功能注釋神器：eggNOG-mapper，KEGG/COG/KOG/GO/BiGG 一網打盡 ? Biostack.org
應該是最好的eggnog-mapper功能注釋教程：應該是最好的eggnog-mapper功能注釋教程 - 簡書（生信媛）
4、PANNZER2-終極注釋網站
此部分為2020年12月24日后加，該工具也是一個網頁版工具。相較于eggNOG-mapper，PANNZER2注釋上的基因條目與Blast2GO差不多，而且，2.5W個基因3-4h就可以拿到結果。如果再整合上InterProScan的結果，那么，這個方法便將高效、準確集于一身。
前方高能:
對于準確性的個人思考，基于比對，也就是基因相似性的注釋方法(blastp,diamond)可能會取決于數據庫的大小，因為在blast2go中有涉及到相似度cut這一步，如果數據庫不夠大，那么相似度有的可能只為50(在cut值之上)，所以只使用Swiss-Prot等小數據庫注釋時可能需要提高cut值;當然也會聽到直系同源和旁系同源的說法，所以在新版Blast2go中增加了filter GO with Taxid (可能是看到eggnog的文章慌了)這一新模塊，減少旁系同源的注釋結果。那么如果要在老版的Blast2go中運用這個模塊，或許可以換個思路，在比對時，通過Taxid來過濾比對結果。
eggnog的注釋，存在兩種模式diamond和hummer，前者官方推薦為存在接近物種，也就是在直系同源注釋中有更好的表現，hummer則反之. 同樣的，只要是比對，就會有cut相似度這一說，數據庫的大小及深度(涉及的物種)，就會影響結果。其一個特點在于直系同源注釋。這點Blast2go中出了filter with Taxid 來補充。
小提示：
參考文獻
http://blog.sina.com.cn/s/blog_16152d7d70102xnc3.html
https://github.com/bbuchfink/diamond
https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI1MjU5MjMzNA==&mid=2247486358&idx=1&sn=4b095e9a200a419079d947d930c38abd&chksm=e9e02237de97ab21f4227ee76eca0aa94433fe6cc374e030093eb3acc2094a546110763bb411&mpshare=1&scene=23&srcid=0101kMbzD2el0RPASBiC9pFi#rd
http://www.jinciwei.cn/a342744.html
https://github.com/bbuchfink/diamond/issues/79
https://github.com/bbuchfink/diamond/issues/159
https://github.com/bbuchfink/diamond/issues/165
http://www.biostack.org/?p=698
http://www.lxweimin.com/p/e646c0fa6443
NGS 生物信息學分析 V6.0 陳連福 鄭越
http://www.lxweimin.com/p/6296385adf21
