eggnog-mapper實現功能注釋
eggNOG-Mapper介紹
通常功能注釋的思路都是基于序列相似性找直系同源基因，常見的方法就是BLAST+BLAST2GO， 或者是InterProScan。eggNOG-mapper的作者認為這種方法不夠可靠，畢竟你有可能找到的的是旁系同源基因。近期對多個工具的整體評估發現eggNOG(evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups)在區分旁系同源基因和直系同源基因上表現不錯，因此基于eggNOG數據庫開發了eggNOG-mapper工具，用于對新序列進行功能注釋。
eggNOG-mapper的算法實現如下：
第一步：序列比對。首先，每條蛋白序列用HMMER3在整理的eggNOG數據庫中搜索。由于每個HMM匹配都和一個功能注釋的eggNOG OG對應，這一步就提供了初步的注釋信息。之后，每條蛋白序列用phmmer在最佳匹配的HMM對應的一組eggNOG蛋白中進一步搜索。最后，每條序列的最佳匹配結果以 seed ortholog 形式存放，用于獲取其他直系同源基因。目前eggNOG HMM數據庫中擁有1,911,745個OG，覆蓋了1,678種細菌,115種古細菌，238種真核物種以及352種病毒。除了HMMER3外，還而可用DIAMOND直接對所有的eggNOG蛋白序列進行搜索，它的速度更快，適合類似于宏基因組這類大數據集，或者是已有物種和eggNOG所收集的物種比較近。當然服務器性能強大的話，還是有限選擇HMMER3.
第二步：推測直系同源基因。每個用于檢索的蛋白序列的最佳匹配序列會對應eggNOG的一個蛋白, 這些蛋白基于預分析的eggNOG進化樹數據庫會提取一組更加精細的直系同源基因。這一步還會根據bit-screo或E-value對結果進行一次過來，剔除同源性不高的結果
第三步：功能注釋。用于搜索的蛋白序列對應的直系同源基因的功能描述就是最終的注釋結果。比如說GO, KEGG, COG等。
安裝
安裝本體eggnog-mapper之前，需要先保證服務器上已經安裝Python3.7(BioPython模塊), wget, HMMER3 和/或 DIAMON，此外你還得保證70G的空間用于存放注釋數據庫和FASTA文件，對于真核生物至少保證90G的服務器內存。
之后從GitHub上將軟件下載到本地
git clone https://github.com/jhcepas/eggnog-mapper.git
之后需要下載所需要的數據庫。eggNOG提供了107個不同物種的HMM數據庫(xxxNOG)以及三個優化數據庫, euk對應真核生物，bact對應細菌, arch對應古細菌(Archeabacteria), 以及一個病毒數據庫(viruses). 這三個優化數據庫包含了屬于該分類內的所有物種的HMM模型。
cd eggnog-mapper
./download_eggnog_data.py euk
此處下載的是真核生物 。下載過程中，它會反復詢問你是否要下載某一類數據，我一律選擇是。
如果你的服務器有多個盤，安裝軟件的分區不夠大，可以在數據盤中創建文件夾進行軟鏈接
cd eggnog-mapper
mkdir /data/database/EGGNOG-DB
rmdir data && ln -s /data/database/EGGNOG-DB data
具體用法
eggnog-mapper用起來非常的簡單，你需要提供蛋白序列作為輸入
#假如我們現在都仍在軟件安裝的路徑下
python emapper.py -i test/p53.fa --output p53_maNOG -d euk
python emapper.py -i test/p53.fa --output p53_maNOG -d maNOG
python emapper.py -i test/p53.fa --output p53_maNOG -d maNOG --usemem --cpu 10
eggnog-mapper默認是以HMMER進行序列搜索，盡管這可以通過-m diamond更改成DIAMOND，但結果中就會缺少一些信息列。HMM的搜索參數，有--hmm_maxhits, --hmm_evalue, --hmm_score, --hmm_qcov和--Z, 一般用默認就行了。
-d/--database表示搜索數據庫的類型，既可以是"euk, bact, arch" 三大類的其中一種，也可以是"eggnog-mapper/data/OG_fasta"中的小類，例如"maNOG"表示的就是哺乳動物的NOG。此外也可以是自定義HMM數據庫， -d /path/to/pfam.hmm
如果服務器內存比較大，線程比較多，可以用--usemem和 --cpu 線程數提高運行速度。
--output表示輸出文件的前綴，默認輸出在當前文件夾下，--output_dir可以更改為其他文件路徑。--resume表示任務重啟后可以跳過之前已經完成的部分， 而--override則表示覆蓋原先的輸出結果。
如果你計劃使用同一個數據庫同時對多個物種進行注釋（大部分人都沒有這種需求），那么你需要以服務器模式啟動eggnog-mapper，然后就可以同時啟動多個任務，
# 終端1
python emapper.py -d arch --cpu 10 --servermode
# 新建一個終端
python emapper.py -d arch:localhost:51600 -i test/polb.fa -o polb_arch
結果解讀
eggnog-mapper會生成三個文件，
-
[project_name].emapper.hmm_hits: 記錄每個用于搜索序列對應的所有的顯著性的eggNOG Orthologous Groups(OG). 所有標記為"-"則表明該序列未找到可能的OG -
[project_name].emapper.seed_orthologs: 記錄每個用于搜索序列對的的最佳的OG，也就是[project_name].emapper.hmm_hits里選擇得分最高的結果。之后會從eggNOG中提取更精細的直系同源關系(orthology relationships) -
[project_name].emapper.annotations: 該文件提供了最終的注釋結果。大部分需要的內容都可以通過寫腳本從從提取，一共有13列。
[project_name].emapper.annotations每一列對應的記錄如下：
-
query_name: 檢索的基因名或者其他ID -
sedd_eggNOG_ortholog: eggNOG中最佳的蛋白匹配 -
seed_orholog_evalue: 最佳匹配的e-value -
seed_ortolog_evalu: 最佳匹配的bit-score -
predicted_gene_name: 預測的基因名，特別指的是類似AP2有一定含義的基因名，而不是AT2G17950這類編號 -
GO_term: 推測的GO的詞條， 未必最新 -
KEGG_KO: 推測的KEGG KO詞條， 未必最新 -
BiGG_Reactions: BiGG代謝反應的預測結果 -
Annotation_tax_scope: 對該序列在分類范圍的注釋 -
Matching_OGs: 匹配的eggNOG Orthologous Groups -
best_OG|evalue|score: 最佳匹配的OG(HMM模式才有) -
COG functional categories: 從最佳匹配的OG中推測出的COG功能分類 -
eggNOG_HMM_model_annotation: 從最佳匹配的OG中推測出eggNOG功能描述
如果打算做富集分析，用命令行的cut/awk提取對應的列，過濾掉其中未注釋的部分就行了。
推薦閱讀
- eggNOG-Mapper的文章: 如果你專門是做數據分析，用別人的軟件的時候最好把文章也看了
- 官方教程: 簡潔明了
