今年9月底發(fā)表在Aging-US（IF=4.831）上的一篇純生信分析文章（“Glioblastoma cell differentiation trajectory predicts theimmunotherapy response and overall survival of patients”），該文章基于GEO的單細胞測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了具有不同分化特征的膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）細胞，繼而進行差異表達分析找到分化相關的基因（GDRG），最后根據(jù)這些基因分別構建了分子分型與預后預測模型。
研究背景介紹
GBM是最常見同時也是死亡率最高的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，5年生存率僅5-6.8%，綜合治療手段，諸如手術、放療、化療、免疫治療等都未能有效延長患者生存時間。腫瘤微環(huán)境中的多種因素會影響腫瘤細胞與腫瘤干細胞（CSC）的分化，從而導致細胞分化狀態(tài)的異質(zhì)性，而單細胞轉錄組學分析為我們提供了一個強大的方法，用于研究整個腫瘤樣品的基因組本質(zhì)，繼而提供了定義和明確細胞狀態(tài)及其分化狀態(tài)的機會。
圖1
結果
1.基于單細胞測序數(shù)據(jù)確定細胞亞群
從GSE84456獲取了來源于4個GBM標本的3589個細胞測序結果，僅有2343個來源于腫瘤核心部位的細胞被納入進一步研究。Seurat R包被應用于單細胞數(shù)據(jù)分析。經(jīng)過質(zhì)控及標準化數(shù)據(jù)，194個低質(zhì)量細胞被排除（圖2A-B）。總共納入19752個基因，方差分析顯示了1500個高度變異的基因（圖2C）。主成分分析PCA未見GBM細胞顯著分離趨勢，我們最終選了20個主成分行進一步分析（圖2D-E）。之后，tSNE分析將GBM細胞分為13個亞群，差異表達分析從所有13個亞群中鑒定出總共8025個標記基因（圖2F-G）。根據(jù)標記基因的表達量，我們使用singleR和CellMarker對各個亞群進行注釋（圖3A）。
圖2
2.腫瘤分化軌跡分析并確定GBM分化相關基因（GDRG）
使用Monocle 2算法進行時序及軌跡分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞主要位于樹根部（root），而2個樹枝（branch）分布有不同的GBM細胞，branch I包含了434個GBM細胞，而branch II包含了444個細胞（圖3B）。差異表達分析得到265個I型GDRG和193個II型GDRG。基因集富集分析（GSEA）發(fā)現(xiàn)I型GDRG與免疫反應調(diào)控相關通路顯著負相關，而II型GDRG與代謝相關通路顯著正相關（圖3C-D）。
圖3
3.TCGA中GDRG的分析
為探索能否在TCGA轉錄組測序結果中找到具有不同分化特征的GBM亞群，相關性分析表明我們可以通過傳統(tǒng)轉錄組測序數(shù)據(jù)中GDRG表達來鑒定I型和II型GBM細胞（圖4A-C），因為這些高度相關的基因可能表明共同的細胞起源。為了確定來自不同GBM細胞亞群的基因是否在功能上相關，我們利用metagene來代表相應基因的整體表達模式，即I型和II型的metagene分別由I型和II型GDRG組成。圖4D-F顯示I型和II型的metagene在單細胞及傳統(tǒng)轉錄組數(shù)據(jù)中高度相關，表明I型和II型GDRG在功能上是高度相互關聯(lián)的。此外，90.8%的GDRG出現(xiàn)了體細胞突變。
圖4
5.免疫檢查點分子（ICM）及免疫治療反應性分析
PD1、PDL1、PDL2在I型GBM細胞亞群（單細胞測序數(shù)據(jù)）和MC1患者（傳統(tǒng)轉錄組測序）中相對高表達，而CTLA4、CD80、CD86在II型GBM細胞亞群和MC2患者中相對高表達（圖6A-C）。根據(jù)TIDE算法，MC2患者對免疫治療的反應性優(yōu)于MC1。此外，SubMap分析發(fā)現(xiàn)MC1對PD1抑制劑反應性更好，而MC2對CTLA4抑制劑反應性更好（圖6D-E）。
圖6
6.構建基于GDRG的預后風險評分模型
套路化的單因素COX回歸，再接著LASSO、多因素COX回歸，繼而構建一個四基因風險評分模型。分析評分計算公式如下：
根據(jù)風險評分的中位數(shù)，將所有患者被分為2組，即高危組和低危組，K-M生存曲線提示高危組患者OS顯著差于低危組。ROC曲線及C指數(shù)均提示較好的預測價值。同樣的結論在CGGA驗證集中得到驗證。
圖7
7.構建預后相關的列線圖Nomogram
套路化的單因素+多因素COX回歸，繼而構建Nomogram，C指數(shù)、ROC曲線、校正曲線均提示較好的預后預測價值。同樣的結論在CGGA驗證集中得到驗證。
圖8
總結
該文章首先挖掘GEO數(shù)據(jù)庫里的單細胞數(shù)據(jù)，通過分化軌跡分析找到了與分化相關的基因，繼而通過TCGA數(shù)據(jù)庫以這些基因為基礎分別構建了分子分型以及預后預測模型。該文章思路新穎，可謂生信分析中的一股清流，令編輯和審稿人耳目一新（僅用1個月即接收），大家不妨按照相似的套路模仿一下，想必不難發(fā)表高分文章。
