十五、結核病原（分枝桿菌、抗酸染色+、卡介苗、結核菌素“OT、PPD”試驗--遲發超敏反應）

結核桿菌：分枝桿菌屬內-主要致病菌（結核分枝桿菌、牛分枝桿菌）
直or稍彎曲細長桿菌，呈V、Y形or條索狀、短鏈狀排列，抗酸染色陽性
生長很緩慢！培養8d↑~8weeks
專性需氧（菌膜生長）、營養要求較高。抵抗力較強
慢性感染、引起肉芽腫
診斷依據：

1. 臨床表現
2. X線檢查
3. 結核菌痰涂片
4. 結核菌素試驗

涂片陽性--病人是重要傳染源
結核感染or接種卡介苗（減毒活疫苗）→產生特異性免疫（感染免疫、又稱有菌免疫）
機體抵抗依賴“細胞免疫”，伴隨“遲發超敏反應”→結核菌素試驗：用結核菌素測定能否引起皮膚遲發超敏反應。
（結核菌素）簡稱“結素”，是通稱：舊結核菌素OT、結核菌素純蛋白衍生物PPD。
用于接種質量考核、篩選預防對象、感染率調查、輔助診斷。
試驗方法：前臂掌側中央、0.1 ml 結核菌素溶液、5~6 mm皮丘、72 h檢查、50 IU/ml制劑硬結直徑5 mm↑為+

• 陰性(-)意義：①未受結核菌感染②已感染但處變態反應前期③免疫系統受干擾④結核性腦膜炎和粟粒性肺結核等使“免疫功能低下”。
• 陽性(+)意義：①結核病患者②結核菌感染但未患病③卡介苗接種④非結核分枝桿菌感染交叉反應

十六、麻風病原（分枝桿菌、胞漿泡沫狀--麻風細胞、抗酸染色--改良Fite染色法）

麻風分枝桿菌：多形性、抗酸性、聚簇性。
典型胞內菌、麻風細胞：胞漿泡沫狀
體外培養失敗
診斷應及時&慎重。皮膚切刮法涂片查菌、組織病理學檢查
涂片染色顯微鏡檢查：鼻黏膜or皮損處取材、抗酸染色（改良的Fite染色法）

十七、空腸彎曲菌CJ、GBS相關、人畜共患、G-

CJ夏秋季高發、旅行者腹瀉主要病因之一
學齡前兒童發病高，與吉蘭-巴雷綜合征GBS密切相關，人畜共患病。

1. 標本采集
   糞便、肛拭，保存于運送培養基中，4 h內送檢or保存液-20℃↓
2. 分離培養
   采樣棉拭子→空彎選擇性血平皿→42℃微需氧（85%N2、10%CO2、5%O2、燭缸法）2~3 d。
   可疑菌落：不溶血、灰色、扁平、濕潤、有光澤、像水滴、1_{2mm、邊緣完整發亮）陰性繼續7}10 d
3. 病原鑒定
   氧化酶&過氧化氫試驗+→革蘭染色：G-、S形、螺旋形、紡錘形→初步確定
   以下試驗5%微需氧培養
4. 42℃&25℃生長試驗：接種2管布氏桿菌肉湯、42/25℃--48 h、
   （42℃生長、25℃不長）
5. H2S產生試驗。空彎、結腸彎曲菌+；胎兒彎曲菌-
6. 馬尿酸鹽水解試驗：空彎+、結腸彎曲菌-。
7. 深入鑒定
   PCR證實

十八、幽門螺桿菌HP（大量高活性尿素酶、cagA基因陽性）

螺桿菌屬（從彎曲菌分出來）。急慢性胃炎、消化性潰瘍最主要病因；胃癌、胃淋巴瘤 密切相關。

1. 標本采集
   胃鏡、胃黏膜活檢組織、保存液（100g/L蔗糖、500ml/L小牛血清）0_8℃12 d；-20℃1~2 m；-80℃ 1 y。冷凍后不可凍融，干冰轉運。
2. 鏡檢
   涂片or病理組織S-W銀染色，敏感性&特異性低。
3. 病原分離
   布氏培基or腦心浸液血瓊脂+5%_{10%羊血&馬血、85%N2、10%CO2、5%O2（orH2）、37℃3}7 d→針尖狀or 1 mm↓半透明菌落
4. 病原鑒定
   HP重要特性：大量高活性尿素酶。觸酶&氧化酶+、快速分解尿素、堿性磷酸酶&γ-谷氨酰轉肽酶活性、硝酸鹽還原實驗陰性。三糖鐵瓊脂不產H2S。
5. 深入鑒定
   cagPAI右側末端DNA--分為 Ⅰ~Ⅴ型
   我國均為cagA基因陽性
6. 快速檢測
   尿素呼吸試驗--簡單快捷，敏感度高。C13非同位素、可用于兒童孕婦。貴！
7. 抗體檢測 HP IgG變換慢，多用于流調

十九、軍團菌（G-桿菌、無莢膜、水解馬尿酸、BCYE-α培養基:焦磷酸鐵&L-半胱氨酸→GVPC(-Cys)選擇性培養基、尿標本中Lp抗原）

嗜肺軍團菌：G-桿菌、無莢膜、無芽孢。不產酸、有鞭毛（鍍銀染色法）、能動。
不易著色、吉姆尼茨染色法or鍍銀染色
分離時需要"L-半胱氨酸，鐵鹽"促生長。
水解馬尿酸鹽--特征

1. 采取標本
   血液、痰（60℃加熱2mins）、尿液
   環境污染調查：應取水樣--空調冷卻水、1L、玻璃、聚乙烯瓶子、使用前洗凈&121℃高壓20mins。
   水樣中生物殺滅劑？容器中+過量滅活劑，6~18℃避光隔熱運送、濃縮培養時間＜14 d。
2. 病原分離
   10^5/L可直接接種、否則先濃縮。過濾、離心→濾出物、沉積物少量水中懸浮。
   樣品→3份：none、酸處理（+等量酸緩沖液搖勻、靜置5±0.5 mins）、熱處理（50±1℃水中30±2 mins）
   BCYE-α培養基:焦磷酸鐵&L-半胱氨酸
   GVPC培養基（選擇性）在BCYE-α加入甘氨酸、多粘菌素B、萬古霉素、放線菌酮。
   3種標本→3個GVPC平板→平板倒置、潮濕、36±1℃、2~5%CO2
   10 d后計數、3平板上各種不同菌落每種2~3個在BCYE & BCYE-Cys（no半胱氨酸）傳代，BCYE生長&BCYE-Cys不長 即認為軍團菌
3. 病原鑒定：免疫熒光方法證實
4. 尿抗原檢測：急性期、恢復期尿標本中Lp抗原。
5. 抗體檢測應用：IFA檢測血清中抗體，滴度4倍↑or單份≥1:256

二十、流感嗜血桿菌(G-球桿菌、有莢膜！含V、X因子才生長、衛星現象）

寄生于鼻咽部、冬季多。3個月~3歲嬰幼兒易感、引起腦膜炎占2/3(神經后遺癥)、小兒肺炎(第2位病原菌)等等各種炎癥。呼吸道傳播。本菌抵抗力弱、100℃立即死亡、干燥痰48 h。

1. 采集標本
   腦脊液、血液、胸水中檢出→臨床意義；耳鼻咽拭子、痰→流行意義
2. 鏡檢：G-球桿菌
3. 病原分離
   巧克力血瓊脂、37℃、pH 7.6、5%CO2、含V&X因子培養基（由血紅蛋白提供的X因子（factors X；血晶素 hemin）和由復合維生素提供的V因子（NAD））才生長
   <u>血平板上不溶血</u>。
   生長在血培養基上金葡菌周圍--衛星現象
4. 病原鑒定
   裂解馬紅細胞能力→從溶血性嗜血桿菌中區分流感嗜血桿菌、從副溶血嗜血桿菌中區分副流感嗜血桿菌。
   吲哚試驗、尿素反應、鳥氨酸代謝→流感嗜血桿菌分為8個生物型，大部分ⅠⅡⅢ型(Ⅰ、Ⅲ型為主)
   有莢膜的為可分型、不可分型（無血清型、來自鼻咽部）
   依據莢膜多糖抗原不同→<u>a~f 血清型</u>；b型流感嗜血桿菌引起絕大多數侵襲性嗜血桿菌感染
5. 深入鑒定
   具莢膜菌株都包含“莢膜多糖基因”cap基因簇、ⅠⅡⅢ部分組成、Ⅱ區為合成血清型特異性基因。依據cap序列設計引物，鑒別流感嗜血桿菌。
   有6種主要外膜蛋白OMP1-6，重要的毒力因子。外膜蛋白電泳圖譜→菌株分類
6. 抗體檢測
   保護性最低抗體水平0.05~0.15μg/ml；發病早期＞0.15μg/ml具有“否定”診斷意義，抗體4倍↑--支持診斷

二十一、克雷伯桿菌（肺炎桿菌、G-較粗短桿菌、有較厚莢膜、多數有菌毛、K抗原-莢膜腫脹實驗）磚紅色、膠凍樣痰液

肺炎桿菌、G-桿菌、有較厚莢膜、呼吸道腸道定殖菌、條件致病菌。老年、營養不良、慢性酒精中毒、慢性支氣管-肺、全身衰竭。占細菌性肺炎2%、病死率30%。

1. 采集標本
   主要：痰液-來自下呼吸道合格標本、也可其他
2. 病原分離
   痰→鹽水洗滌3次→1%胰酶溶液、37℃水中90 mins：均質化
   血瓊脂培養基、麥康凱，37℃、24 h→血瓊脂上菌落大、黏液型、光亮、黏稠、可拉絲。
3. 病原鑒定
   選擇性培養基上--發酵乳糖
   <u>O抗原、K抗原</u>--用以分型（莢膜腫脹實驗）3、12型
   magA基因--高黏性表型、用作診斷。rmpA基因--輔助診斷

二十二、衣原體-細胞內寄生、還有立克次體（G-、通過細胞濾器、McCoy細胞、免疫熒光-包涵體\吉姆薩(暗視野顯微鏡觀察)比碘染敏感）

非運動性細菌、有細胞壁、G-、廣泛寄生動物細胞內、僅少數致病性
無合成ATP、GTP能力、能量寄生物、能通過*細胞濾器、嚴格細胞內寄生、原核細胞型
周期2個階段：原生小體elementary body感染階段-感染力；網狀小體initial body繁殖階段-增殖力
1采取標本
眼部、生殖道→拭子→懸浮在抗生素肉湯/細胞培養基→混合、離心10 mins→去上清→抗生素溶液稀釋1:2 & 1:20
淋巴膿腫黏性→研磨、懸浮在細胞培養液；血凝塊→懸液；痰、咽喉洗液→含抗生素肉湯。
含冰塊運輸培養液--2sP、加不同濃度胎牛血清:增加發現率、維持感染性。-60℃保存、4℃融化、研磨乳懸液、稀釋后接種抗生素培養基
2病原分離
環乙酰亞胺處理的McCoy細胞→48~72 h→染色、免疫熒光的單克隆抗體方法--檢測衣原體的包涵體
3病原鑒定
免疫熒光、碘染色、吉姆薩染色→檢測蓋玻片上的包涵體；吉姆薩(暗視野顯微鏡觀察)比碘染敏感

二十三、支原體（G-、油煎蛋樣菌落、缺乏細胞壁、最小獨立微生物、通過除菌濾器、人型支原體pH 6.6、解脲支原體pH 6.0、酶聯吸附捕獲法P1蛋白-肺炎支原體）

缺乏細胞壁、原核細胞型、已知獨立生活最小微生物！通過除菌濾器。
16種、5種致病：肺炎支原體、（解脲、人型、生殖、發酵）支原體--泌尿生殖道感染
1采集標本
黏膜組織→拭子涂抹取樣、分泌液→支原體液體培養基小管
組織塊→研磨成乳漿狀接種
2病原分離
需要豐富“膽固醇、血清蛋白、酵母浸液”。5%CO2、95%N2、36~37℃。
加入0.002%酚紅指示劑、可加醋酸鉈及抗生素等抑菌劑
人型支原體pH 6.6、解脲支原體pH 6.0、其他7.6~8.0
*油煎蛋樣菌落--太小、低倍鏡看
G-但不易著色、吉姆薩：淡紫色、Dienes染色：藍色不易褪色--可鑒別
3病原鑒定
表格：支原體與細菌病毒等特征
能通過450nm濾膜？
4快速檢測
雙抗體夾心ELISA法測支原體“外膜蛋白”&免疫印跡測支原體“抗原”
酶聯免疫吸附試驗捕獲法：肺炎支原體，170kDa膜蛋白（P1抗原）的單抗測呼吸道“P1蛋白”,3 h,敏感性10^4 CFU/ml[一萬菌落形成單位]
核酸雜交技術、PCR--各種基因
5抗體檢測：4倍↑--診斷意義