- Serrat X, et al. (2014) EMS mutagenesis in mature seed-derived rice calli as a new method for rapidly obtaining TILLING mutant populations. Plant Methods 10(1):5.
背景技術TILLING（靶向誘導的基因組中的局部損傷）是一種反向遺傳方法，其將化學誘變與高通量全基因組篩選相結合，用于感興趣的基因中的點突變檢測。然而，這種突變發現方法面臨著如何獲得具有足夠高的突變密度的突變群體的特殊問題。此外，在分析基因型可以開始之前，植物誘變方案需要連續兩代（M1，M2）進行突變定位。\ n結果：在此，我們描述了一種基于甲磺酸乙酯（EMS）的水稻新的TILLING方法，成熟種子來源的愈傷組織的誘變和體外再生植物的直接篩選。當植物篩選兩個衰老相關基因時，獲得高誘變率（即每451Kb中一個突變）。篩選在來自6912突變體群體的2400名個體中進行。確定了15個點突變中的7個意義上的變異突變。\ n \ n結論：這種新策略在時間節省，溫室空間和突變植物種群生成期間的工作方面（即超過8個月）具有顯著的優勢。此外，這種有效的化學誘變方案確保了高誘變率，從而通過誘變體積減少而節省了廢物去除成本和所需的誘變劑總量。
背景
水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的糧食作物之一。它也是分子生物學和遺傳學的典型谷物植物[1]，由于其相對于其他谷物的小基因組大小，整個基因組序列的可用性[2]，易于轉化和再生，以及多樣性的可用性的突變體。由于水稻基因組的測序于2004年12月完成[2]，功能基因組學被用于確定所有大約50,000個注釋基因的功能[3,4]。通過開發各種基因敲除策略已經達到了這一目標[5-7]。
有3種方法可以通過以下方式誘導突變：1）生物制劑如轉座子和T-DNA，2）物理試劑，如快中子，紫外線和X射線輻射，或3）化學藥劑如N - 甲基-N-亞硝基脲（MNU），1,2：3,4-二環氧丁烷（DEB）或甲磺酸乙酯（EMS）。在這些化合物中，EMS已經成為植物中最有效，最可靠，最強大和最常用的化學誘變劑[8]。 EMS主要誘導產生C / G至T / A轉換的C?Vto-T取代[9,10]，而在低頻下，EMS通過7-乙基鳥嘌呤生成G / C至C / G或G / C至T / A轉換水解或A / T到G / C轉換通過3-乙基腺嘌呤配對錯誤[9-12]。
長期以來，已經將照射和化學誘變用于產生用于育種的突變植物[13,14]。突變的分子篩選在化學誘變劑產生小缺失和點突變得到改善的效率之后得到發展[8,9,15,16]，DNA測序允許鑒定這種點突變。然而，在大量人口中的直接測序是一個緩慢而昂貴的過程。因此，開發了基于物理性質的幾種突變檢測技術[17-24]，之前酶不匹配檢測方法為高效突變種群篩選提供了關鍵。從曲霉菌[25]，Vigna radiata [26]或Penicillium [27]獲得的內切核酸酶是用于檢測DNA錯配的第一種酶。 Oleykowski等[28]通過使用從電影步驟獲得的來自枸杞子的CEL I內切核酸酶改進了該技術，從而為高通量篩選技術鋪路。從那時起，酶檢測方法與高通量基因分型結合已被改進，用于遺傳多態性的有效檢測[29-32]。因此，在模型生物體中使用輻射和化學誘變用于功能基因組學研究的興趣越來越大[33,34]。
化學誘導的突變體種群已經在不同的植物物種中產生[11]，并有效篩選了靶向誘導的基因組（TILLING）高通量篩選方案中的局部損傷[35-37]。這些結合隨機化學誘變與靶基因的聚合酶鏈反應（PCR）擴增，異源雙鏈體形成和一系列等位基因變化的鑒定[38]，通過使用酶學錯配切割和電泳。在具有大基因組的植物物種中實現全基因組飽和突變體種群具有挑戰性。小型基因組物種如水稻更適合TILLING [30,39,40]。結果，許多水稻突變體群體已經使用這種技術進行了有效的篩選[36,41-43]。
在TILLING化學誘變方法中，將發芽種子在誘變溶液中孵育。直接從誘變處理產生的第一代（M1）不能篩選，因為大多數產生的突變是體細胞的，不能傳播到后代[30]。為了解決這個問題，M1突變種群必須生長然后自我受精。 M1性結構中的突變可以產生整個突變的M2后代，從而避免由嵌合引起的任何歧義。所得的M2后代可以篩選出突變。
目前可獲得的組織培養方法和誘變技術可顯著縮短育種過程，克服一些重大的農藝和環境問題。在大多數情況下，胚胎來源的水稻愈傷組織再生僅由幾個細胞產生。因此，可以直接篩選來自突變愈傷組織的再生M1小植株，而無需等待自花授粉的M2群體。已經報道了在未來的胚胎，來自成熟種子的愈傷組織或最近受精的小穗中的單個合子細胞的水稻誘變育種的嘗試很少，已報道[44-47]。最近報道了用于突變體表型檢測的懸浮培養的水稻細胞的誘變[48]。然而，迄今為止，已經報道了為了獲得TILLING的突變種群，在成熟種子來源的水稻愈傷組織中沒有化學誘變的研究。
這項工作的目的是實施一個新的TILLING策略，基于來自EMS誘變的胚胎來源的愈傷組織的植物突變種群的生產，然后在再生植物上進行突變篩選。這種突變篩選集中在與衰老有關的兩個基因上，因為每年谷物作物的發育過程與繁殖期重疊，并且可能在不利的環境條件下過早誘導時可以降低作物產量。
