背景
? ??二代測序技術(shù)（NGS）的快速發(fā)展促使各種有機(jī)體的高通量測序數(shù)據(jù)的累積，特別是細(xì)胞器基因組。因此，為了應(yīng)對各種生物細(xì)胞器基因組的基因注釋，需要用于功能基因注釋的更優(yōu)化的工具。盡管目前存在多種注釋軟件，但由于研究的類群不同，注釋軟件的選擇會存在一些差異。這里將匯總大概介紹目前比較流行的注釋軟件，希望能對大家有幫助（其實(shí)是來回饋簡書大佬們各類干貨的分享）。
細(xì)胞器基因組包括質(zhì)體基因組（即葉綠體基因組）和線粒體基因組，動物細(xì)胞器基因組只有線粒體基因組。
葉綠體基因組具有高度保守四分體結(jié)果，由大單拷貝序列（ Large Single copy Region，LSC）、小單拷貝區(qū)（ Small Single copy Region，SSC）、反向重復(fù)區(qū)A和反向重復(fù)區(qū)B（Inverted Repeat Region，IR）組成。其中，IRA和IRB為兩個反向重復(fù)序列組成的。葉綠體基因組長度一般在為120-220 kb ，約編碼 110 ～ 130 個基因，其中編碼基因（Coding Sequence，CDS）一般約為80，30個tRNA，4個rRNA。其中CDS gene—rps12為跨界基因（外顯子部分在LSC，部分在2個IR內(nèi)），是葉綠體基因注釋中一個非常需要注意的基因。另外部分植物會存在基因組結(jié)果變異（如豆科IR缺少一個等）及基因的丟失與假基因化（如寄生植物）。
植物線粒體基因組由于大量重復(fù)序列的存在導(dǎo)致其基因組大小差異懸殊，222~983kb。基因組數(shù)據(jù)龐大、基因密度低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等原因使得植物線粒體基因組的研究不及質(zhì)體基因組。相對于植物線粒體而言，動物線粒體較為簡單且易于純化，僅有15～20 kb。但關(guān)于線粒體基因組注釋的軟件也不多，主要有針對植物線粒體基因組注釋: Mitofy，針對動物線粒體基因組注釋: DOGMA、GeSeq，以及可注釋幾乎真核生物所有的線粒體基因組：AGORA。
干貨區(qū)
各類基因注釋軟件適用類群：
AGORA Annotation
優(yōu)點(diǎn)：
? ? ? ? 1. ? ? 可注釋幾乎真核生物所有葉綠體和線粒體基因組；
? ? ? ? 2. ? ?? 提供基因外顯子和內(nèi)含子的注釋；
? ? ? ? 3. ? ?? 提供每個基因起始子和終止子位置信息；
? ? ? ? 4. ? ?? 用戶可更改參考用于核基因和細(xì)菌基因組注釋；
? ? ? ?? 5. ? ?? 可生成GB格式（GeneBank）；
? ? ? ?? 6. ? ? ? 網(wǎng)頁操作簡單、設(shè)置參數(shù)較少。
缺點(diǎn)：
? ? ? ? ? 該軟件尚未用過，有待進(jìn)一步補(bǔ)充。
必調(diào)參數(shù)：
query sequence（查詢序列）
reference sequences（參考序列）??????????? NCBI/自定義
genetic code （遺傳密碼）
count of maximum matched genes（最大匹配基因數(shù)）???? 設(shè)為1，僅顯示匹配度最高的候選基因；
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 大于1，可識別其它匹配基因和分析外顯子和內(nèi)含子。
網(wǎng)址：AGORA - Annotator for Genome of Organelle from the Reference sequences Analysis
工作流程圖（實(shí)線為氨基酸流程，虛線為核苷酸流程）：
優(yōu)點(diǎn)：
? ? ? 1. ?? 反向Blast搜索的方法確定基因在葉綠體基因組上的位置，不依賴龐大的數(shù)據(jù)庫，顯著提高了注釋的速度，約一分鐘一個種；
? ? ?? 2. ?? 軟件包含新開發(fā)的基因和內(nèi)含子特征邊界檢測算法，極大提高了基因和內(nèi)含子邊界注釋的準(zhǔn)確性；
? ? ?? 3. ?? 作為一個本地注釋葉綠體基因組的命令行工具，可以運(yùn)行于任何配置Perl和Blast的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)環(huán)境，同時可以自主選擇葉綠體基因組參考序列，大大提高了葉綠體基因組注釋的靈活性；
? ? ? ? 4. ? ?? 能生成日志文檔輔助用戶檢查注釋結(jié)果；
? ? ? ?? 5. ? ?? 可以批量注釋。
缺點(diǎn)：
? ? ? ? ? 1. ? ? 無網(wǎng)頁版，需在命令端運(yùn)行；
? ? ? ? ?? 2. ?? 參考序列需要嚴(yán)格的GB格式；
? ? ? ? ?? 3. ?? 不能有太多參考序列，否則會產(chǎn)生沖突，一般兩個，；
? ? ? ? ?? 4. ? ?? 無法畫圖。
網(wǎng)址：GitHub - quxiaojian/PGA: Plastid Genome Annotator
具體操作流程和注意事項(xiàng)：葉綠體基因組注釋軟件PGA使用說明 - 簡書
流程圖：
CpGAVAS2 Annotation
優(yōu)點(diǎn)：
? ? ? ? 1. ? ?? 注釋準(zhǔn)確率高，可以準(zhǔn)確注釋petB，petD、rps16基因（具小型外顯子：<10bp）和rps12基因（反式剪切基因）；
? ? ? ? 2. ? ?? 注釋所有可能的基因；
? ? ? ? 3. ? ?? 支持使用3類參考數(shù)據(jù)集（RNA-seq data——the 43-plastome dataset，NCBI所有數(shù)據(jù)庫——2544-plastome dataset；用戶自定義參考序列集）
? ? ? ? 4. ? ?? 可以Summary repeats，并在基因組圖中顯示（結(jié)果如下圖所示）；
? ? ? ?? 5. ? ?? 能生成日志文檔輔助用戶檢查注釋結(jié)果。
缺點(diǎn)：
? ? ? ?? 1. ? ? 只能單個樣本注釋；
? ? ? ?? 2. ? ? 注釋速度慢，一般為半小時注釋一個基因組。
網(wǎng)址：http://www.herbalgenomics.org/cpgavas/
流程圖：
GeSeq Annotation
優(yōu)點(diǎn)：
? ? ? 1. ? ? 存在畫圖功能（OGDRAW），畫圖好看；
? ? ? 2. ? ? 可以自主選擇是否提供自己的參照序列，有合適的參考序列即可注釋動物的線粒體基因組（該功能尚未被很好的驗(yàn)證）；
? ? ? 3. ? ? 可批量注釋，可注釋100條以上序列；
? ? ? 4. ? ? 不僅能注釋整個葉綠體基因組或區(qū)域，也可以注釋Contigs；
? ? ? 5. ? ? 可提基因。
缺點(diǎn)：
? ? ? 號稱可以注釋rps12 gene,但rps12 gene實(shí)際注釋效果不好。
網(wǎng)址：http://blog.sciencenet.cn/blog-3406804-1192085.html
流程圖：
最后，無論注釋軟件初步注釋多么精確，始終需要手動注釋進(jìn)行校正，以確保注釋的正確性。因此，初步注釋的結(jié)果需導(dǎo)入其他工具進(jìn)行基因校正。
