今天學習測序相關知識
學習內容
怎么區分一二三代測序
二代測序大體流程
NGS組學都包括哪些分類（粗略）
測序原理和過程
原理介紹視頻：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密碼： 密碼：bxsry4
文章《測序的世界》：http://www.lxweimin.com/p/101c14c3a1d2
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一代測序-Sanger法測序（準確，慢，成本高,至今仍是測序行業的金標準。）
Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應，在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列
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二代測序-大規模平行測序（不準確，快，成本降低）
illumina公司最優，原理
- DNA待測文庫構建
- 簇的創建
- 橋式PCR擴增及變性
- 測序
測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4中dNTP（如同Sanger測序法）。這些dNTP的3’-OH被化學方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發熒光所需的緩沖液，用激光激發熒光信號，并有光學設備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機分析將光學信號轉化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護基團，以便能進行下一輪的測序反應。Illumina的這種測序技術每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準確測量問題，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序為例，30x測序深度大約為1周。
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三代測序-單分子測序技術（SMRT不準確，納米技術準確，成本低，快）
與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。 DNA聚合酶和模板結合,4色熒光標記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發出不同光,根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。
組學分類
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基因組學（核酸序列分析）
（1）全基因組測序（WGS）
（2）全外顯子組測序（WES）
（3）簡化基因組測序（RRGS）
①RAD-Seq基因組作圖（遺傳圖譜、物理圖譜、轉錄本圖譜）
②GBS核苷酸序列分析
③2bRAD基因定位
④ddGBS（也就是ddRAD）基因功能分析
（4）以全基因組測序為目標的結構基因組學
（5）以基因功能鑒定為目標的功能基因組學
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轉錄組學（基因表達分析）
（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（長鏈非編碼RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）
作用：
（1）獲得物種或者組織的轉錄本信息
（2）得到轉錄本上基因的相關信息，如基因結構功能等
（3）發現新的基因
（4）基因結構優化
（5）發現可變剪切
（6）發現基因融合
（7）基因表達差異分析
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蛋白組學
作用：
（1）蛋白質組數據處理、蛋白及其修飾鑒定
（2）構建蛋白質數據庫、相關軟件的開發和應用
（3）蛋白質結構功能預測
（4）蛋白質連鎖圖
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代謝組學
（1）代謝物指紋分析
（2）代謝輪廓分析
測序發展史：150年的風雨歷程
【陳巍學基因】Illumina測序化學原理（講的很好，小白能聽懂）
視頻概要：
芯片表面有8個通道，上面都做了化學修飾，兩種DNA引物通過共價鍵種在玻璃表面（不會被沖掉flowcel）。
DNA文庫：加了接頭的DNA（打斷，加A，加接頭）。
橋式PCR：將加了DNA文庫結合在芯片上擴增（接頭盒玻璃表面引物互補），然后NaOH解鏈，然后再結合接頭擴增，解鏈，擴增。。。
測序：帶熒光的dNTP確定堿基
Index：文庫中加了特定的序列，每個樣本加一個。標記樣本來源。
雙端測序：正負向各測一遍
