關于Fastq格式的一些想法

最近想寫一個關于多軟件批處理序列的腳本,在觀察文件的過程中,發現了.fq格式和.fastq格式心中不免有些疑問——這兩種格式有什么區別,查詢資料后,在此闡述一下對fastq文件格式的看法。

FASTQ是基于文本的,保存生物序列(通常是核酸序列)和其測序質量信息的標準格式。其序列以及質量信息都是使用一個ASCII字符標示,最初由Sanger開發,目的是將FASTA序列與質量數據放到一起,目前已經成為高通量測序結果的事實標準。

格式說明

FASTQ文件中每個序列通常有四行:

  1. 序列標識以及相關的描述信息,以‘@’開頭;
  2. 第二行是序列
  3. 第三行以‘+’開頭,后面是序列標示符、描述信息,或者什么也不加
  4. 第四行,是質量信息,和第二行的序列相對應,每一個序列都有一個質量評分,根據評分體系的不同,每個字符的含義表示的數字也不相同。

例如:
@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
++
!''((((+))%%%++)(%%%%).1-+''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

HWI-1KL118 the unique instrument name
98 the run id
C374TACXX the flowcell id
4 flowcell lane
1101 tile number within the flowcell lane
1247 'x'-coordinate of the cluster within the tile
2191 'y'-coordinate of the cluster within the tile
1 the member of a pair, 1 or 2 (paired-end or mate-pair reads only)
N Y if the read fails filter (read is bad), N otherwise
0 0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number
TTAGGC index sequence

關于質量編碼格式

質量評分指的是一個堿基的錯誤概率的對數值。其最初在Phred拼接軟件中定義與使用,其后在許多軟件中得到使用。其質量得分與錯誤概率的對應關系見下表:

Phred quality scores are logarithmically linked to error probabilities

:Phred Quality Score: : Probability of incorrect base call: :Base call accuracy:
10 1 in 10 90 %
20 1 in 100 99 %
30 1 in 1000 99.9 %
40 1 in 10000 99.99 %
50 1 in 100000 99.999 %

Phred quality scores Q are defined as a property which is logarithmically related to the base-calling error probabilities P.
除了Phred質量得分換算標準,還有就是Solexa標準:


兩種換算標準的比較:

Relationship between Q and p using the Sanger (red) and Solexa (black) equations (described above). The vertical dotted line indicates p = 0.05, or equivalently, Q ≈ 13.

對于每個堿基的質量編碼標示,不同的軟件采用不同的方案,目前有5種方案:

  • Sanger,Phred quality score,值的范圍從0到92,對應的ASCII碼從33到126,但是對于測序數據(raw read data)質量得分通常小于60,序列拼接或者mapping可能用到更大的分數。
  • Solexa/Illumina 1.0, Solexa/Illumina quality score,值的范圍從-5到63,對應的ASCII碼從59到126,對于測序數據,得分一般在-5到40之間;
  • Illumina 1.3+,Phred quality score,值的范圍從0到62對應的ASCII碼從64到126,低于測序數據,得分在0到40之間;
  • Illumina 1.5+,Phred quality score,但是0到2作為另外的標示,詳見http://solexaqa.sourceforge.net/questions.htm#illumina
  • Illumina 1.8+
下面是更為直觀的表示:

SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS.....................................................
..........................XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX......................
...............................IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII......................
.................................JJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJ......................
LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL....................................................
!"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~

  • S - Sanger Phred+33, raw reads typically (0, 40)
  • X - Solexa Solexa+64, raw reads typically (-5, 40)
  • I - Illumina 1.3+ Phred+64, raw reads typically (0, 40)
  • J - Illumina 1.5+ Phred+64, raw reads typically (3, 40)
    with 0=unused, 1=unused, 2=Read Segment Quality Control Indicator (bold)
    (Note: See discussion above).
  • L - Illumina 1.8+ Phred+33, raw reads typically (0, 41)

文件后綴

沒有特別的規定,通常使用.fq, .fastq, .txt等
FASTQ格式的序列一般都包含有四行,第一行由@開始,后面跟著序列的描述信息,這點跟FASTA格式是一樣的。第二行是序列。第三行由'+'開始,后面也可以跟著序列的描述信息。第四行是第二行序列的質量評價(quality values,注:應該是測序的質量評價),字符數跟第二行的序列是相等的。

FASTQ格式例子:

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
++
!''((((+))%%%++)(%%%%).1-+''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

例如在NCBI看到的FASTQ格式如下:

@SRR001666.1 071112_SLXA-EAS1_s_7:5:1:817:345 length=36
GGGTGATGGCCGCTGCCGATGGCGTCAAATCCCACC
+SRR001666.1 071112_SLXA-EAS1_s_7:5:1:817:345 length=36
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII9IG9IC

FASTQ格式與Fasta格式、GenBank等格式的相互轉換

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