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綜述文章，只翻譯，不評論，為了開拓眼界。

摘要：卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一。經初步診斷，大多數患者表現為腹腔內廣泛的轉移性生長。這種轉移性生長是分階段發生的，轉移前生態位的形成發生在宏觀腫瘤細胞侵襲之前。原發性卵巢腫瘤釋放的外泌體是一種細胞外小泡，為加速轉移侵襲準備了遠處腫瘤微環境。它們調節腫瘤細胞與正常間質、腫瘤相關成纖維細胞和腫瘤微環境內局部免疫細胞之間的細胞間通訊。在這篇綜述中，我們強調卵巢癌外泌體作為轉移前生態位形成的協調物、適合液體活檢的生物標記物和化療靶點的新作用。

背景：卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤，占所有女性癌癥的2.5%，占女性癌癥相關死亡的5%。在美國，2018年約有22240例新診斷卵巢癌病例，14070例死亡。卵巢癌患者的死亡率很高，因為通常在晚期（III或IV）被診斷為腸梗阻和全身受累[3]。在這些晚期III期或IV期病例中，卵巢癌的5年生存率低于29%，而早期I期患者的5年生存率為70%[4]。因此，迫切需要研究卵巢癌轉移的機制及相關的生物標志物，以便早期診斷和治療卵巢癌I期患者。

最近的研究表明，卵巢癌轉移前的生態位是轉移的普遍先決條件。轉移前生態位是一種預先形成的微環境，由腫瘤原發部位在廣泛轉移前分泌的外泌體所形成。這些外泌體優化了卵巢癌定植、生長和轉移的環境。這種環境是通過免疫抑制和逃避、血管生成、癌相關成纖維細胞（CAF）和重塑局部間質的腫瘤巨噬細胞介導的。各種研究表明，外泌體在腫瘤的發生、生長、凋亡、免疫反應和腫瘤的化療抵抗中起著關鍵作用（圖1a）。然而，直到最近，它們在轉移前生態位建立中的作用才得到重視。盡管直徑為30-100nm，這些盤狀膜囊泡含有蛋白質、脂質、DNA和RNA的獨特特征，使其成為強大的致瘤因子和診斷生物標記物。在卵巢癌的腹水和血液中都可以檢測到外泌體，使他們易于接受微創診斷和早期靶向治療的潛在目標。本文就外泌體在卵巢癌轉移中與轉移前生態位形成的關系進行綜述。

外泌體發生。

外泌體的性質和豐度取決于其來源的供體細胞-無論是健康組織還是腫瘤。外泌體生物發生涉及一系列細胞事件，最終導致致癌或生理亞型。供體細胞首先內化細胞外配體和產物，形成早期內體。新生的外泌體在內腔小泡（ILVs）的管腔內形成，最終通過蛋白質、核酸和脂類的選擇性包合而成熟為多泡內涵體（mve）。有些MVE在溶酶體內融合和降解，為細胞形成提供必要的能量和物質，而另一些MVE則通過高爾基體再循環或直接細胞分泌釋放到細胞外環境中。運輸所需的內涵體分選復合體（ESCRT）是膜成形和斷裂的主要驅動力，也是MVE和ILV形成的第一個公認機制。最終的外泌體物質驅動其最終功能，并通過一系列高度選擇性的調控階段來實現。它包括內蛋白分類和通過ESCT-0、?I、?II和-III以及VPS4、VTA1、ALIX/PDCD6IP和TSG101將泛素化蛋白質精確ESCT裂解為ILV。脂質如神經酰胺、膽固醇和四個跨膜蛋白超家族（包括CD9、CD63和CD81）也介導外泌體蛋白的分類。在核酸水平上，外體mRNAs根據其3′UTR的Z-拉鏈結構以及RNA誘導的沉默復合物（RISCs）被分為mve。ARF6-Exportin-5軸將miRNA前體運送到腫瘤微泡中。這些調控方法揭示了卵巢癌外泌體從周圍健康組織中獲得獨特分子特征的機制。

卵巢癌外泌體

卵巢癌與其他人類腫瘤的不同之處在于它喜歡通過腹水侵入腹膜腔，這使得它特別擅長于累及腔室內的各種臟器。從早期開始，腹水包含分離的腫瘤細胞、各種免疫細胞、間皮細胞和腫瘤相關的外泌體。這些外泌體可以從卵巢癌患者的腹水和血清中分離出來。重要的是，這些外顯體含有卵巢癌特有的蛋白質特征，包括膜蛋白（Alix，TSG101）、小GTPases（Rab蛋白）、膜聯蛋白、四肽（CD9、CD82、CD63和CD81）、熱休克蛋白（Hsp90、Hsc70）、抗原（MHCI和II）、Nanog和酶（磷酸異構酶、過氧化物酶、醛）還原酶，脂肪酸合成酶（圖1b）。除了揭示一種潛在的惡性腫瘤外，外泌體蛋白載物還具有促進卵巢腫瘤轉移的作用（表1）。

例如，Nanog是一種轉錄調節因子，參與腫瘤細胞增殖和腫瘤干細胞的自我更新。與良性腹膜液相比，從高級別漿液性卵巢癌腹水中取樣的外顯子體中Nanog的表達明顯更高。Nanog基因敲除研究顯示卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力下降。致瘤microRNAs（miRNA）也已在外泌體中被鑒定出來，在外泌體中它們被包裹并防止核酸酶降解。在功能上，這些外泌體內的miRNAs可局部和系統地調節靶細胞的基因表達。一旦脫落，卵巢癌源性外泌體水平地將其miRNAs轉運至腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、間皮細胞和腫瘤細胞本身。它們為惡性腫瘤早期轉移前生態位的形成和轉移提供了指導。

外泌體在轉移前生態位內引起免疫抑制

免疫系統是轉移的重要屏障。為了使卵巢癌在新的環境中茁壯成長，轉移前的生態位保護轉移細胞在進入轉移部位時不發生凋亡是非常重要的。從卵巢癌腹水中分離出的外泌體可以誘導快速可逆的T細胞阻滯。最近的一項研究發現，GD3是一種神經節苷脂，在從腹水中分離出來的外體表面表達，通過作用于T細胞受體（TCR）來阻止T細胞。卵巢癌相關外泌體也可以通過激活toll樣受體（TLR）誘導單核細胞產生IL-6。IL-6激活免疫細胞、間質細胞和腫瘤細胞中的信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）通路，從而支持癌細胞的整體免疫逃逸。

為了揭示外顯體對免疫細胞的直接作用，各種研究將卵巢癌患者腹水中的外泌體與樹突狀細胞、造血干細胞和外周血淋巴細胞共培養。其中一項研究顯示，外泌體通過誘導造血干細胞、樹突狀細胞和外周血淋巴細胞凋亡來引起免疫抑制（圖2a）。在另一項研究中，正常外周血淋巴細胞與卵巢癌腹水或良性卵巢囊腫患者腹腔沖洗液中的外泌體共培養，并對淋巴細胞進行基因表達分析。他們發現與良性卵巢囊腫組相比，惡性腹水共培養組有26個免疫抑制基因的過度表達。這些發現支持外泌體通過與白細胞的直接相互作用來抑制外周免疫，從而使腫瘤不受損害。包括CD4+和CD8+T細胞在內的適應性免疫反應，以及先天性免疫細胞在轉移的地方被強烈招募。這些免疫細胞是對抗腫瘤進展的強有力的生理防御。越來越多的證據表明，來自卵巢癌細胞的外泌體可以使腫瘤微環境中的免疫細胞沉默，并在轉移前的生態位形成中起關鍵作用。除了重新編程免疫細胞基因圖譜，卵巢癌細胞還釋放攜帶Fas配體（FasL）的外泌體促進T細胞凋亡。在細胞水平上，溶血磷脂酸提高卵巢癌細胞表面FasL的表達，從而促使FasCarrieng外泌體的釋放。此外，卵巢癌外泌體攜帶磷脂酰絲氨酸，通過阻斷細胞內信號級聯抑制T細胞活化。NK細胞是一類重要的先天性免疫效應細胞，直接識別和殺傷腫瘤細胞。NKG2D受體配體是NK細胞重要的激活細胞毒性受體，也是卵巢癌外泌體下調的靶點。抑制NKG2D可以避免NK細胞的細胞毒性，允許腫瘤細胞免疫逃避和強大的轉移前生態位。

外泌體促進轉移前生態位的血管生成

為確保充足的血液供應，VEGFR1+造血祖細胞在轉移前生態位內啟動血管生成。此外，局部內皮祖細胞通過VEGF信號促進血管生成。除了血管生長外，促血管生成的微環境增加了多種細胞類型（包括VEGFR1+造血祖細胞、免疫細胞、基質細胞和腫瘤細胞歸巢）的血管通透性。這種先前的血管生成使得轉移前的生態位能夠滿足隨后快速轉移生長的營養需求。卵巢癌外泌體最近因促進血管生成而聲名狼藉（圖2b）。其中一項研究證明了它們能夠增強人臍靜脈內皮細胞的活性和遷移能力。在分子水平上，蛋白質組學揭示了位于卵巢癌外顯體中的激活轉錄因子2（ATF2）和轉移相關蛋白1（MTA1）上調血管生成。CD147是一種在癌細胞中表達的致瘤膜結合分子，它調節腫瘤周圍基質細胞中基質金屬蛋白酶的表達。卵巢腫瘤釋放的CD147陽性外泌體也促進人臍靜脈內皮細胞的血管生成。卵巢癌患者的腹水中以一種獨特的非血管內皮生長因子（VEGF）為載體的可溶性E-cadherin（sE-cad）是一種強有力的血管生成激活劑。從機制上講，sE-cad陽性外泌體與內皮細胞上的VE-cadherin結合，促使信號級聯，最終激活βcatenin和NF-κB；這刺激內皮細胞遷移和總體血管通透性。盡管其體積小，但越來越多的研究支持卵巢癌源性外泌體在培養廣泛腹膜轉移的血管生成腫瘤生態位中的作用。

基質重塑中的外泌體

從原發腫瘤轉移到繼發部位的癌細胞的存活取決于間質微環境。腫瘤源性外泌體通過培養和重塑轉移部位的間質細胞來協助這一過程，以支持腫瘤細胞的生存和轉移擴散。在功能上，他們重新編程的基質細胞在轉移前的生態位，包括癌相關成纖維細胞（CAFs）和周細胞。在轉移性微環境中，外泌體也與腫瘤相關巨噬細胞（TAM）相互作用，負責腫瘤生長、侵襲、血管生成和整體轉移。

外泌體將成纖維細胞轉化為CAFs

CAFs是一種獨特的、重編程的間質細胞，在腫瘤發生、細胞外基質重塑、進展、轉移前生態位形成和轉移中發揮作用。它們在局部基質細胞微環境中分泌TGF-β、基質細胞衍生因子-1α（SDF-1α）、S100A4、纖維連接蛋白和基質金屬蛋白酶的致瘤細胞因子環境。雖然這些信號分子在形成腫瘤微環境方面具有獨特和特殊的過程，但它們都有助于轉移前生態位內的基質重塑。在一項研究中，比較了正常成纖維細胞和卵巢癌旁成纖維細胞的miRNA譜，發現卵巢腫瘤旁成纖維細胞一致地顯示miR-31和miR-214下調，miR-155上調。這些研究人員通過將miR-31和miR-214模擬物或miR-155抑制劑轉染到正常成纖維細胞中，使其轉化為CAFs，從而證明了miRNA信號的重要性。這表明卵巢癌來源的外泌體本身就足以誘導正常間質成纖維細胞表型和功能的改變，形成致病性CAFs（圖2c）。類似的研究也支持了外泌體在正常間質向CAFs過渡中的作用。卵巢癌能夠通過過度表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、SDF-1和TGF-β，將脂肪源性間充質干細胞轉化為CAFs。因此，正常間質向癌間質的重編程可以通過細胞因子信號在繼發性轉移生長之前介導。

外泌體誘導巨噬細胞極化。

巨噬細胞是多功能抗原提呈細胞，典型地分為兩種極化表型：促炎性（M1）和抗炎（M2）。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）屬于M2亞型，可滲透到惡性組織中。在腫瘤微環境中，TAMs分泌IL4、IL-5和IL-6，促進血管生成、基質重塑和免疫系統抑制。它們還通過STAT3信號級聯分泌TGF-β、SDF-1和VEGF來促進轉移前的生態位。在卵巢癌中，缺氧誘導因子（HIF）誘導釋放富含各種miRNAs的外顯體，包括miR-21–3p、miR-125b-5p和miR-181d-5p。當這些外泌體被未分化的巨噬細胞吞噬時，它們通過細胞因子信號（SOCS）4/5/STAT3途徑的抑制因子進行M2極化（圖2d）。最近的一項研究表明，卵巢癌細胞與巨噬細胞共培養后，只能通過外顯體將癌基因miR-1246轉移到M2巨噬細胞而不是M1巨噬細胞。作為后續研究，miR-1246抑制劑和化療方案的聯合應用顯著降低了體內腫瘤負擔。這些新興的研究支持了M2亞型在腫瘤發生和轉移前生態位形成的多個階段的作用。

轉移前生態位中的外泌體培養細胞促進轉移

卵巢癌外泌體直接促進腫瘤細胞在轉移前的生態位內歸巢、定植和生長，同時抑制宿主的抗腫瘤免疫反應。它們還通過促進宿主細胞向TAM和CAF表型轉化來促進腫瘤細胞增殖和侵襲（表3）。實驗證據表明，體外培養的tam能夠在體外和體內小鼠模型中促進卵巢癌的增殖和遷移。這是由于TAMs的細胞因子譜的結果，它們分泌大量的EGF，從而激活外周卵巢癌細胞中的EGFR。這種EGF/EGFR信號級聯上調血管內皮生長因子C（VEGF-C），進而上調整合素和細胞間粘附分子（ICAM-1）。這會誘導卵巢癌細胞的增殖、遷移、粘附、球體形成和腹膜植入（圖3b）。在轉移前的生態位中，腫瘤來源的外泌體將局部成纖維細胞轉化為CAFs，CAFs通過自身的外泌體分泌支持腫瘤的發生。當卵巢癌細胞攝取富含TGFβ1的CAF外泌體時，它們上調TGFβ1的表達，并通過SMAD信號級聯更善于遷移和侵襲。除此之外，CAFs還能增強基底膜的通透性，使腫瘤細胞更好地侵入未侵犯的局部間質。化療和外泌體功能之間存在著獨特的相互作用。有趣的是，最近有研究表明，乳腺癌外泌體在化療后增強了肺轉移前的生態位形成能力。（化療會促進腫瘤轉移看來不止我這么認為哈）在另一項研究中，研究人員展示了一線化療藥物順鉑通過激活NFκB信號通路增加卵巢癌患者產生IL6的肌纖維母細胞CAFs。此外，他們還證明，用眾所周知的糖尿病藥物二甲雙胍預處理可以抑制基質NFκB/IL6的激活，并降低卵巢癌細胞的化療耐藥反應。轉移性和耐藥的復發性卵巢癌與匹配的原發性腫瘤相比產生明顯高的IL-6。卵巢癌患者腹水中IL-6水平升高與預后不良相關。

在轉移前的生態位中，外泌體突破了腫瘤侵襲的屏障

大約70%的卵巢癌患者在手術時有腹膜轉移。典型的腫瘤細胞巢涉及腹膜、大網膜、腸系膜、膈肌和腹盆內臟表面（圖3a）。這些轉移灶是由腹水內的腫瘤引起的；然而，血源性轉移到大網膜的病例也會發生。組織學上，大網膜和腹膜都是松散的膠原網絡，有血管化的結締組織、分散的成纖維細胞、脂肪細胞和巨噬細胞。它們被一層富含微絨毛的間皮細胞和一層薄薄的基底膜所覆蓋（圖3b），循環中的卵巢癌細胞必須破壞這層細胞。轉移的方式決定了侵襲的障礙。在血行途徑中，腫瘤細胞穿透內皮細胞表面，在腹水途徑中，腫瘤細胞浸潤間皮。

卵巢癌外泌體通過誘導血管內皮細胞遷移促進血管生成，促進腫瘤細胞歸巢到轉移前的生態位。腹膜臟器轉移性生長明顯缺乏間皮，表明這些細胞在腫瘤發生過程中被清除，可能發生在大規模轉移性侵襲之前。從機制上講，卵巢癌細胞釋放帶有特異性miRNAs的外泌體（例如miR-21和miR-29a）進入腹水，從而重塑間皮細胞層以增強腹膜穿透力（圖2e）。卵巢癌患者血清miR-99a-5p顯著升高，促進細胞侵襲。CD44在卵巢癌大網膜轉移患者腹膜間皮細胞中高表達。這是通過外泌體條件途徑發生的，卵巢癌外泌體將CD44轉移到腹膜間皮，從而清除其物理屏障。MMP1表達與卵巢癌預后有關。這些蛋白酶的mRNA水平地從卵巢癌胞外體轉移到腹膜間皮，通過自我破壞引起腹膜間皮細胞凋亡。

外泌體作為轉移前生態位生物標志物及其治療應用

早期發現轉移前的生態位仍然是婦科腫瘤學領域的一個重要目標，尤其是考慮到與晚期診斷相關的嚴重不良結果。因此，新技術已尋求檢測高滲透性、缺氧和炎癥區域，以及具有轉移生態位特征的細胞外基質改變區域。然而，許多這些技術的準確性較低，尚不適合臨床應用。外泌體作為轉移前生態位形成的生物標志物具有許多獨特的優勢，因為它們非常穩定、豐富且具有腫瘤特異性。因此，它們是血液或腹水中有希望的生物標志物，值得對這種致命癌癥進行認真的研究，尤其是考慮到它們在其他癌癥中的成功。例如，攜帶遷移抑制因子（MIF）的胰腺腫瘤的外顯體被肝臟內的Kupffer細胞選擇性攝取，因此在肝轉移前生態位形成中起著重要的啟動因子。同樣，黑色素瘤特異性蛋白酪氨酸酶相關蛋白2（TYRP2）的外體水平作為黑素瘤轉移的預測因子已經引起了人們的興趣。

液體活檢是一種可以從體液（如血液或腹水）中分析循環腫瘤細胞、無細胞核酸和腫瘤來源的外泌體的技術。2016年1月21日，首個基于外泌體的癌癥診斷產品在美國上市。這項技術特別適用于卵巢癌的診斷，因為外泌體可以以相對非侵入性的方式從腹水中檢測出來。液體活檢中最先進的生物傳感器通過高度特異性的靶點選擇、生物抗原傳感和信號轉導技術檢測癌變的外泌體。至于靶點選擇，miR-200b和miR-200c的水平與卵巢癌的不良預后相關，并且與卵巢腫瘤標記物CA-125顯著相關。腫瘤相關抗原在外泌體表面顯著，可用于高靈敏度的癌細胞檢測。例如在膠質瘤（GBMs）中富含VEGF-A、信號蛋白3A和TGF-β的外泌體，鼻咽癌中的HIF1-α，纖維肉瘤和黑色素瘤中的MT1-MMP。這些與外泌體相關的蛋白質對于其來源的癌癥來說是獨一無二的，因此特別是對于未知癌癥亞型的患者來說，是液體活檢檢測的理想靶點。為了達到這個效果，各種惡性腫瘤已經被研究，包括黑色素瘤、鼻咽癌、乳腺癌、結直腸癌和卵巢癌。最近，一種基于微流控芯片的液體活檢技術能夠分離出卵巢癌中含有詳細蛋白質和信號通路的外泌體。

基于外泌體的治療策略也正在出現，并通過利用外泌體對原發癌細胞的歸巢效應發揮作用。通過將卵巢癌外泌體植入工程化生物材料中并植入小鼠模型的腹腔內，產生轉移前的小生境模擬物。這種人工的轉移前生態位有效地從腹水中吸收并捕獲游離卵巢癌細胞，從而阻止這些細胞向正常盆腔臟器歸巢。存活率顯著提高。另一項新興技術利用細胞靶向適體修飾的胞外囊泡，其外泌體嵌入黑磷中。當適配子將生物誘導的細胞外小泡導向靶細胞時，黑磷衍生的無機磷酸鹽促進了細胞的生物礦化。這種靶向技術有可能消除轉移前的生態位，是未來化療研究的一個新領域。

當準備轉移前的生態位時，腫瘤來源的外泌體經歷到首選的器官和細胞特異性的位置。外體蛋白質組學揭示了整合素的表達模式在這一過程中起主要作用。外泌體整合素α6β4和α6β1促進肺轉移，αvβ5與肝轉移有關。治療上，靶向整合素α6β4a和dαvβ5分別減少外顯體攝取和肺、肝轉移。這些外體整合素是液體活檢中轉移前生態位形成的另一個預測因子，對高轉移率的癌癥尤其有價值?？偟膩碚f，由于不同的癌癥在其各自的轉移前小生境中表現出不同的機制和外泌體特征，因此腫瘤特異性生物標記物和治療策略很可能具有可接受的特異性。此外，考慮到卵巢癌外泌體中存在的轉移前生物標記物及其在轉移前生態位形成中的作用，近年來液體活檢診斷技術的進展使外顯體成為早期篩查和檢測的一個有希望的新領域。