一篇RNA-seq分析流程的綜述，全面而詳細(xì)！深度好文，可用來反復(fù)閱讀。初學(xué)者用于把握RNA-seq真?zhèn)€流程及各個(gè)流程選擇上的差異。已經(jīng)開始學(xué)習(xí)者可用來查缺補(bǔ)漏和發(fā)現(xiàn)新的分析角度。
A survey of best practices for RNA-seq data analysis
摘要：
沒有任何一個(gè)RNA-seq分析流程可適用于所有的轉(zhuǎn)錄組分析。討論RNA-seq分析流程主要步驟：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，質(zhì)控，比對(duì)，基因水平和轉(zhuǎn)錄組水平定量，可視化，基因差異表達(dá)，可變剪接，功能分析，融合基因檢測(cè)，eQTL (expression quantification trait loci,表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn))。展望轉(zhuǎn)錄組研究存在的問題。
背景：
研究材料基因組信息已知，通過將RNA-seq獲得的序列比對(duì)到基因組上獲得轉(zhuǎn)錄信息；研究材料無基因組信息則從頭拼接reads為contigs后將reads比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組。
基因組注釋已知，基于注釋基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析或發(fā)挖掘新的轉(zhuǎn)錄組及其調(diào)控通路。其次研究者可以對(duì)感興趣的mRNA亞型表達(dá)或microRNA水平或等位變異分析。在此分析過程中可以只進(jìn)行RNA-seq分析也可以聯(lián)合其他組學(xué)一起分析。
不同的RNA-seq分析有不同的轉(zhuǎn)錄組定量，均一化以及差異表達(dá)分析，并且質(zhì)控可確保結(jié)果的可重復(fù)性和可靠性。圖一為Illumina sequencing實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析流程圖。簡(jiǎn)單羅列一些數(shù)據(jù)及圖例來說明這些分析中潛在的不足。最后討論single cell RNA-seq（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組）及測(cè)序長(zhǎng)度比較（3代測(cè)序和2代測(cè)序）。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
文庫類型、測(cè)序深度、重復(fù)，準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)操作以確保數(shù)據(jù)未被污染。
首先：RNA提取中去除大量存在的rRNA， 通常占總RNA的90%，mRNA為1-2%。
提取mRNA可選擇用ployA選擇性富集mRNA或刪除rRNA。ployA通過RNA intergrity number （RIN，RNA完整度）來表示mRNA的比例，對(duì)于不能產(chǎn)生高質(zhì)量和足夠數(shù)量的材料則用刪除rRNA法來獲得mRNA（例如細(xì)菌mRNA無多聚A）。
另一個(gè)問題是：是否產(chǎn)生strand-preserving libraries， strand-specific protocols 如dUTP法，通過在第二條cDNA合成時(shí)加入U(xiǎn)TP，先于接頭連接隨后含有dUTP的鏈被降解。測(cè)序長(zhǎng)度小于500bp，分單端測(cè)序（single end，SE）和雙端測(cè)序（paired-end，PE）。讀長(zhǎng)較長(zhǎng)（long reads）的序列及雙端序列更有利于注釋信息較差的轉(zhuǎn)錄組分析。
其次：測(cè)序深度及文庫大小。測(cè)序較深的到的轉(zhuǎn)錄組信息及轉(zhuǎn)錄本數(shù)量更加詳細(xì)，但不是越深越好。?
5百萬條比對(duì)序列對(duì)中到高表達(dá)基因的量化分析足夠，100萬條序列足以分析低表達(dá)基因分析，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組通常為1百萬，高表達(dá)基因測(cè)序5萬，脾組織只需2萬。
文庫大小取決于目標(biāo)轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜程度，測(cè)序深度有利于轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量和鑒定，但同時(shí)增加了雜質(zhì)信息和脫靶轉(zhuǎn)錄本。飽和曲線可以用來評(píng)估給定測(cè)序深度下轉(zhuǎn)錄組的覆蓋度。
最后：樣本重復(fù)，包括測(cè)序時(shí)不同批次的差異及樣本的差異。至少3個(gè)重復(fù)
box2
RNA-seq文庫準(zhǔn)備和測(cè)序過程中包擴(kuò)：RNA打段，cDNA合成，接頭，PCR擴(kuò)增，bar-coding，lane loading，這些過程可能會(huì)增加測(cè)序結(jié)果的偏好性。
外源參考轉(zhuǎn)錄組（exogenous reference transcripts，‘spike-ins’）可用來作為質(zhì)控以及文庫大小矯正。 若測(cè)序量較大，降低技術(shù)誤差：文庫準(zhǔn)備時(shí)不同批次及l(fā)ane的樣本完全隨機(jī)，或每個(gè)樣本單獨(dú)進(jìn)行barcoding，然后在多個(gè)illumina lane中，加入所有的樣本進(jìn)行測(cè)序。
RNA-seq數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)分析的主要步驟：質(zhì)控，比對(duì)（分：有參考基因組、無參考基因組），獲得基因及轉(zhuǎn)錄本表達(dá)矩陣，基因差異分析。也討論可變剪接，轉(zhuǎn)錄本融合，小RNA表達(dá)，可視化工具。
1. 質(zhì)控檢測(cè)
1.1 原始序列
包括：序列質(zhì)量，GC含量，接頭，過高k-mers，重復(fù)reads。同一研究中重復(fù)度，k-mer或是GC含量應(yīng)該已知，不一致性大于30%則剔除。常用FastQC。
準(zhǔn)則：3‘末端序列質(zhì)量下降時(shí)需要?jiǎng)h除以增加比對(duì)率。FASTX-Toolkit 和Trimmomatic用來去除低質(zhì)量序列，去接頭，去掉低質(zhì)量堿基。
1.2 比對(duì)
最重要的是比對(duì)到 ：基因組或是轉(zhuǎn)錄組上的比對(duì)率。
人類基因組的比對(duì)率期望值是70-90%，會(huì)出現(xiàn)多個(gè)序列比對(duì)在有限的序列區(qū)稱之為“多重比對(duì)序列”（multi-mapping reads）；
轉(zhuǎn)錄組上的比對(duì)率較低，由于未注釋的轉(zhuǎn)錄本會(huì)被過濾且“多重比對(duì)序列”增加，由于同一個(gè)基因不同亞型共有外顯子區(qū)。
另一個(gè)參數(shù)：序列覆蓋度在外顯子和比對(duì)鏈上的均一性。3‘末端轉(zhuǎn)錄本聚集表明序列質(zhì)量差，GC含量可以顯示PCR偏好性，指控工具包括：Picard，RSeQC，Qualimap。
1.3 量化
樣本內(nèi)轉(zhuǎn)錄本定量后需檢測(cè)GC含量以及基因長(zhǎng)度偏好性來居定是否進(jìn)行矯正。確認(rèn)無rRNA，smallRNA（R 包NOISeq或EDASeq 對(duì)計(jì)數(shù)進(jìn)行質(zhì)控）。
1.4 重復(fù)
整個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)的可重復(fù)性檢測(cè)來排除批次效應(yīng)（技術(shù)重復(fù)系數(shù)Spearman R2 > 0.9）。若相同條件下基因表達(dá)量有差異則主成分分析（principle component analysis，PCA）應(yīng)聚在一支。
2. 轉(zhuǎn)錄本
有參分析時(shí)將序列比對(duì)到參考基因組或是轉(zhuǎn)錄組上獲得表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組上會(huì)屏蔽新的未注釋的轉(zhuǎn)錄本，只對(duì)已知轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量分析。
無參時(shí)先組裝為長(zhǎng)contigs后已contig作為表達(dá)轉(zhuǎn)錄組將reads比對(duì)上去進(jìn)行定量分析，或者覆蓋度可用于對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量。區(qū)別在于轉(zhuǎn)錄和定量同時(shí)完成還是順序完成。
2.1? 比對(duì)
有參比對(duì)分兩種：基因組比對(duì)和轉(zhuǎn)錄組比對(duì)（圖2a，b），一條或多條序列（multireads）都可以比對(duì)在特定的位點(diǎn)。
多比對(duì)由于重復(fù)序列或是有共同結(jié)構(gòu)域的旁系同源基因而導(dǎo)致，在比對(duì)在基因組上會(huì)產(chǎn)生顯著性的比對(duì)結(jié)果，在轉(zhuǎn)錄組為參考基因組時(shí)由于基因異構(gòu)體（insoform）含有共同的外顯子而更顯著，結(jié)果保留。在基因表達(dá)變化時(shí)轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)和定量更加困難。
box3 比對(duì)到參考序列
比對(duì)到參考基因組可發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和基因，需要gap或剪接map由于序列可能跨越剪接區(qū)。要發(fā)現(xiàn)正確的剪接區(qū)尤其是參考基因組中存在錯(cuò)誤或差異或者無保守區(qū)和融合轉(zhuǎn)錄本。
?Tophat分兩步進(jìn)行無剪接序列先比對(duì)到外顯子，沒比對(duì)的序列被分開比對(duì)來尋找外顯子區(qū)。比對(duì)時(shí)參數(shù)設(shè)置取決于文庫，錯(cuò)配數(shù)，reads的長(zhǎng)度和類型及測(cè)序長(zhǎng)度。
2.1 轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)
新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)困難在于：Illumina讀長(zhǎng)短(short reads)，難跨越剪接區(qū)不能直接的到轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)；轉(zhuǎn)錄本的起始和終止位點(diǎn)難確定。
PE reads(雙端測(cè)序）和該覆蓋率有利于發(fā)現(xiàn)低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，重復(fù) 有利于解決假陽性率（false-positive call）。
Cufflinks, iReckon , SLIDE和StringTie與注釋相結(jié)合將其加到可能的異構(gòu)體（insoform）中，Montebello將異構(gòu)體的發(fā)現(xiàn)與定量用似然法比對(duì)，Augustus可講轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與編碼蛋白轉(zhuǎn)錄本注釋很好的結(jié)合，但非編碼轉(zhuǎn)錄本較差。
2.2 從頭合成轉(zhuǎn)錄本重建
無參序列組裝為轉(zhuǎn)錄本，SOAPdenovoTrans， Oases，Trans-ABySS或Trinity。無參轉(zhuǎn)錄組需PE reads和讀長(zhǎng)較長(zhǎng)的序列。無參分析在計(jì)算機(jī)分析時(shí)測(cè)序較深時(shí)要降低序列的數(shù)量。樣本間比較分析時(shí)，建議將多個(gè)樣本的所有序列都合并為一個(gè)輸入文件來的到一個(gè)穩(wěn)健的contigs（transcripts），然后比對(duì)回短序列進(jìn)行表達(dá)量評(píng)估。
從頭組裝導(dǎo)致產(chǎn)生十或上百的contigs作為轉(zhuǎn)錄本片段，長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)如Bioscience 的SMRT提供讀長(zhǎng)可以為多數(shù)基因提供完整的轉(zhuǎn)錄本。
3. 轉(zhuǎn)錄本定量
RNA-seq分析核心為基因和轉(zhuǎn)錄本的定量分析，基于比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的數(shù)量。
最簡(jiǎn)單的定量方法是用HTSeq-count或featureCounts累積原始數(shù)量。
基因水平定量使用GTF（genome transfer format ）文件，包含外顯子和基因，通常丟棄很多序列。原始序列數(shù)量不能用于比較樣本與樣本間的表達(dá)水平，由于受到轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度，總測(cè)序數(shù)以及測(cè)序偏好性的影響。
RPKM是樣本內(nèi)均一化方法，用于去除長(zhǎng)度和樣本大小的影響（RPKM：reads per kilobases of exon model per millions reads）,FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped read)與RPKs和TPM（transcripts per million）類似，都用于樣本內(nèi)歸一化，F(xiàn)PKM可以與TPM相互轉(zhuǎn)化。
樣本內(nèi)和樣本間的區(qū)分導(dǎo)致在文章中較為混亂。相同基因在樣本與樣本之間的表達(dá)量比較時(shí)，其長(zhǎng)度不需要矯正。但同一個(gè)樣本內(nèi)對(duì)基因表達(dá)排序時(shí)必須的由于較長(zhǎng)的序列回累積更多的reads。樣本之間Cufflinks得到基因長(zhǎng)度顯著不同不同忽略。？？？？（備注：到底應(yīng)該怎么辦？）
轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)計(jì)算基于相同的轉(zhuǎn)錄本 共有 多數(shù)序列來進(jìn)行計(jì)算。TopHat用最大期望值來對(duì)轉(zhuǎn)錄本的豐富度進(jìn)行計(jì)算。Cufflinks使用GTF信息來發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本或只從比對(duì)序列提供從頭合成的轉(zhuǎn)錄本。從轉(zhuǎn)錄本比對(duì)量化表達(dá)包括SEM (RNA-Seqby Expectation Maximization)，eXpress，Sailfish，kallisto。
轉(zhuǎn)錄本中容許多比對(duì)reads以及將序列偏好性矯正后樣本內(nèi)均一化值輸出。RSEM使用最大期望值并返回TPM值。NURD為SE reads提供轉(zhuǎn)錄組表達(dá)評(píng)估，占內(nèi)存低。
4. 差異基因表達(dá)分析
差異表達(dá)分析需要將樣本與樣本之間的基因表達(dá)值進(jìn)行比較。
RPKM，F(xiàn)PKM和TPM在樣本間進(jìn)行比較時(shí)將測(cè)序深度進(jìn)行歸一化，但當(dāng)樣本有雜合性轉(zhuǎn)錄本分布即高且差異表達(dá)特性偏離count分布時(shí)結(jié)果較差。NOISeq R包包含大量的分析plots對(duì)每種情況進(jìn)行合適的歸一化步驟。除樣本內(nèi)，樣本間差異，批次效應(yīng)可能會(huì)產(chǎn)生影響，COMBAT或ARSyN可以剔除批次效應(yīng)。
RNA-seq定量分析基于reads counts絕對(duì)或可能匹配到轉(zhuǎn)錄本上（波松或負(fù)二項(xiàng)分布）。絕對(duì)-離散概率分布-小片段樣本變異不同的表達(dá)包括在內(nèi)時(shí)不適合。
edgeR將原始輸入reads計(jì)數(shù)及可能的偏好性帶入數(shù)據(jù)模型，將歸一化和差異分析同時(shí)進(jìn)行，類似的為DESeq2（負(fù)二項(xiàng)分布）。baySeq和EBSeq為貝葉斯法（負(fù)二項(xiàng)分布），不同實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的差異以及每組內(nèi)每個(gè)基因的后驗(yàn)概率。
無參法NOISeq或SAMseq做最小假設(shè)，從真實(shí)數(shù)據(jù)中為理論分析做空值分布估算。最小生物學(xué)重復(fù)為3。不同算法顯著性的影響分析的結(jié)果，因此要表明參數(shù)設(shè)置，版本，以及考慮生物學(xué)重復(fù)。
5. 可變剪接分析：差異異構(gòu)體表達(dá)。
同一基因轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的表達(dá)為可變剪接。分析方法分兩類：將異構(gòu)體表達(dá)評(píng)估與差異表達(dá)檢測(cè)結(jié)合來對(duì)總基因表達(dá)中每個(gè)異構(gòu)體占比的變化進(jìn)行計(jì)算，兩步結(jié)合后第一步的不確定性考慮在內(nèi)：數(shù)據(jù)分析來尋找差異異構(gòu)體表達(dá)。
基于外顯子分析法（exon-based）省略異構(gòu)表達(dá)和可變剪接的信號(hào)檢測(cè)通過比較兩個(gè)比對(duì)樣本之間基因外顯子和連接區(qū)序列分布DEXseq和 DSGSeq （基因外顯子count），rMATS（連接區(qū)reads），rDiff（可變區(qū)域基因readscounts），DiffSplice用比對(duì)圖來發(fā)現(xiàn)可變剪接模型。優(yōu)點(diǎn)：exon或junction法可精準(zhǔn)的發(fā)現(xiàn)單個(gè)可變剪接；exon-based適合特殊的外顯子和功能結(jié)構(gòu)域，不適合整個(gè)異構(gòu)體分析。
6. 可視化
可視化可以在reads水平（ReadXplorer)或在處理深度(read pileup), 未均一化 (總count) 或均一化后（基因組瀏覽器 UCSC browser，Integrative Genomics Viewer (IGV) , Genome Maps 或Savant，RNAseqViewer查看多個(gè)RNA-seq樣本，展示風(fēng)豐富的外顯子，轉(zhuǎn)錄本，連接區(qū)，但比IGV慢。
7. 發(fā)現(xiàn)融合基因
染色體重排產(chǎn)生融合基因與新異構(gòu)體基因鑒定方法類似，但跨度更大。
假的融合基因由于多態(tài)性，同源異記序列錯(cuò)誤而導(dǎo)致的比對(duì)錯(cuò)誤而產(chǎn)生。過濾多態(tài)性豐富和同源配對(duì)基因，也過濾掉不可能參與基因融合的高表達(dá)基因如rRNA。另外野生型中在近融合區(qū)存在低頻的二體可能以為著高表達(dá)基因的錯(cuò)配。
若得到正確的chimeric，下一步是得到有生物學(xué)功能的融合基因。當(dāng)融合出現(xiàn)在對(duì)照數(shù)據(jù)中時(shí)可能會(huì)被過濾，當(dāng)無對(duì)照數(shù)據(jù)時(shí)，大量不相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫同時(shí)出現(xiàn)，且過濾后出現(xiàn)真正的融合時(shí)則表明artifacts。
8. Small RNAs
sRNA通常包含18-34堿基，有miRNA, siRNA（小干擾RNA），PIWI-交互RNAs（PIWI-interacting RNA，piRNAs）以及其他類型的調(diào)控分子。由于其復(fù)雜度小測(cè)序通常為2-10 百萬reads，于RNA-seq分析方法有不同。去接頭：動(dòng)物中，長(zhǎng)度為22和23bp，植物種21和24bp。
sRNA需用Bowtie2，STAR，Burrows-Wheeler Aligner (BWA)比對(duì)到參考基因組上。未比對(duì)上的潛在的重復(fù)序列需要剔除。每個(gè)基因組上通常容許5-20個(gè)不同的mapping。保證無mRNA降解污染。
下一步的分析步驟包括與已知sRNA比較以及從頭發(fā)現(xiàn)sRNAs。miRDeep用于動(dòng)物分析，miRDeep-P用于植物，or the trans-acting siRNA預(yù)測(cè)工具 UEA sRNA Workbench。miRTools 2.0，ShortStack和 iMir能為sRNA文庫綜合注釋，并鑒定多種 sRNAs分類
9. RNA-seq功能注釋
標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄組分析最后一步：差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的功能和通路分析。
兩個(gè)主要的方法：比較差異表達(dá)基因與剩余基因組，基因富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）基于差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本排序。
功能分析需要對(duì)研究的材料有可用及豐富的功能注釋。
Gene Ontology，Bioconductor，DAVID或Babelomics包含多數(shù)模式物種的注釋數(shù)據(jù)。
從頭組裝所得到的新轉(zhuǎn)錄本缺乏注釋信息，編碼蛋白注釋可以基于序列相似性用旁系同源功能注釋（SwissProt），以及保守蛋白結(jié)構(gòu)域用Pfam和InterPro。一般有50-80%的轉(zhuǎn)錄本可以被注釋。缺少編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本為長(zhǎng)非編碼RNA（long non-coding RNA）,相似性注釋可用于短非編碼RNA，而對(duì)于長(zhǎng)非編碼RNA還沒有相應(yīng)的注釋。
與其他數(shù)據(jù)類型相結(jié)合
1. 與DNA測(cè)序結(jié)合
RNA與DNA測(cè)序相結(jié)合可用來發(fā)現(xiàn)單堿基多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）RNA-編輯，表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)（expression quantitative trait loci，eQTL）。
經(jīng)典的eQTL研究中，同一類型的組織基因型和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)量大于50，然后檢測(cè)基因型和表達(dá)水平的關(guān)系，用來解釋復(fù)雜性狀基因偏好性。大量的eQTL研究表明基因變異影響多數(shù)基因的表達(dá)
RNA-seq在檢測(cè)eQTL方面有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)：發(fā)現(xiàn)影響轉(zhuǎn)錄過程的變異；雜合性SNP可以分布比對(duì)到父本和母本上，對(duì)個(gè)體內(nèi)等位基因特異性表達(dá)進(jìn)行定量分析。
2. DNA甲基化
DEGs和甲基化模型的相關(guān)分析，然而通過線性相關(guān)性，貝葉斯相關(guān)性，邏輯相關(guān)性模型得出兩者的相關(guān)性較低。
網(wǎng)絡(luò)互作分析RNA-seq與DNA甲基化之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)基因有差異表達(dá)和差異甲基化的協(xié)同性。
3. 染色質(zhì)特征
RNA-seq與轉(zhuǎn)錄元件（transcription factor，TF）染色質(zhì)免疫沉降測(cè)序（ChIP-seq）數(shù)據(jù)用來剔除ChIP-seq中的假陽性和表明目的基因上TF的激活或抑制。
ChIP-seq數(shù)據(jù)組蛋白修飾用來表示表觀修飾對(duì)基因表達(dá)量的改變。DNase-seq可用于DNA結(jié)合因子的基因組印記，與基因的表達(dá)相結(jié)合可用于研究轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)活性。
4. MicroRNAs
兩種數(shù)據(jù)相結(jié)合可能用來解釋轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定水平miRNA的調(diào)控作用。
5. 蛋白組及代謝組
與蛋白組數(shù)據(jù)結(jié)合有爭(zhēng)議由于兩者的相關(guān)性低（～0.4）。然而仍可以用來發(fā)現(xiàn)新異構(gòu)體。用RNA-seq預(yù)測(cè)未報(bào)道的肽鍵或事轉(zhuǎn)錄后編輯。與代謝組結(jié)合可用來發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)和代謝水平的調(diào)控通路。
6.多數(shù)據(jù)類型聯(lián)合及可視化
蛋白–蛋白, DNA–蛋白, miRNA–mRNA 互作網(wǎng)絡(luò)來發(fā)現(xiàn)miRNA–基因調(diào)控模型。
展望
目前轉(zhuǎn)錄組分析主要方面：少量的供試材料 和長(zhǎng)序列中 更好的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本
1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（single-cell RNA-seq）
前沿和火熱的研究區(qū)域。Smart-seq和Smart-seq2只需極少量的供試材料，可通過單個(gè)細(xì)胞的擴(kuò)增得到。可用于發(fā)現(xiàn)組織中新的未分類的細(xì)胞類型。一類單細(xì)胞文庫與細(xì)胞群相比，發(fā)現(xiàn)多細(xì)胞亞群與表達(dá)基因相結(jié)合。
少量的供試材料以及PCR擴(kuò)增限制了測(cè)序深度，因而一般測(cè)序少于1百萬reads。scRNA-seq測(cè)序深度增加可能有利于同源特異性表達(dá)基因的挖掘，但表達(dá)量的增加鮮有提高。
scRNA含有3000-8000個(gè)表達(dá)基因，加入?yún)⒖嫁D(zhuǎn)錄本以及特異性分子標(biāo)記（uniqe molecule identifiers，UMI）有利于克服偏好性擴(kuò)增并提高基因定量。
scRNA-seq比對(duì)在轉(zhuǎn)錄組參考基因組上不能發(fā)現(xiàn)新的基因，若研究目的未基因表達(dá)量則用轉(zhuǎn)錄組未參考基因組來減少工作量。
2.長(zhǎng)測(cè)序
短序列限制性在于不能精準(zhǔn)的沖否完整的轉(zhuǎn)錄本。Pacific-Bioscience（PacBio）SMRT和Oxford Nanopore獲得長(zhǎng)序列。PacBio在cDNA分子上加接頭形成一個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)，此單鏈用來多次測(cè)序。Nanopore GridION可直接用RNA合成酶和RNA特異性堿基進(jìn)行測(cè)序。Moleculo技術(shù)準(zhǔn)備文庫時(shí)復(fù)合和限制DNA分子長(zhǎng)度，將這些特定長(zhǎng)度的鏈分開標(biāo)記然后重新融合測(cè)序。 PacBio最常見。
缺點(diǎn)：測(cè)序錯(cuò)誤率高，不能用于從頭合成需要參考基因組；SMRT細(xì)胞數(shù)量較低阻礙了轉(zhuǎn)錄本定量分析。
