一、sam、bam簡介
1、sam
Sequence Alignment/Map format，直譯就是序列比對格式；
-
序列比對是測序結果分析中最基礎的一步操作，它主要基于參考序列信息回答了每條reads來自人的哪條染色體的哪個區域；
sequence mapping 目前的比對軟件很多，例如bwa，star，bowtie2，算法也各有差異，但究其比對結果都是以sam純文本格式展現；
在sam格式中，對比對情況、比對質量、PE雙端比對等各種比對可能結果都有全面的記錄，具體會在下面介紹。
2、bam
- 簡單來說，bam格式就是sam的二進制版本；
- 因為，sam最大的缺點就是文件體積太大，而bam格式可完整保留sam信息同時，可明顯降低文件大?。凰砸话銉H保留bam文件進行后續分析。
- samtools可實現sam與bam間的轉換，以及查看bam內容，具體操作示例見筆記最后
3、序列比對小例子
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如下圖所示，準確來說是5條reads的比對結果，其中具體比對情況為--
image.png
（1）r001/1與r001/2是PE測序的pair/mate reads，現在遇到的基本都是雙端測序；
（2）r002、r003、r004都是單獨的一條read(在這個圖片結果是這樣，也許對應的pair reads比對到很遠的位置，甚至其它染色體上)；
（3）r003出現兩次是因為其可比對到參考序列的不同位置，但是注意 -r003表示是其reverse reads比對上的；
（4）reads序列中的大寫字母表示與參考序列對應堿基相同，小寫字母則表示不一致；星號或點號表示考慮insert/delete情況，reads才能比對到參考序列中； -
而sam格式有系統的規則，可簡潔、全面的描述上述比對結果，如下圖所示。
image.png
在PE雙端測序中 pair reads與mate pairs概念基本相同，區別見https://www.biostars.org/p/77293/
2、sam格式剖析
2.1 header部分（optimal）
- 以
@開頭為標志，從不同角度為比對結果補充信息； -
常見的有以下四類
sam header - （1）
@HD如果有，必須放在第一行
VN表示sam格式的版本號，SO說明比對結果是否排序了 - （2）
@SQ說明參考基因組的情況，一般會有很多行
SN表示染色體名字，對應比對結果的RNAME列；LN表示該染色體的長度 - （3）
@PG則說明比對軟件情況
ID表示程序ID號(一般與PN相同)，PN表示軟件名，VN表示軟件版本號，CL表示產生該sam的命令語句 - （4）
@RG主要說明測序樣本信息
ID，在一條lane只有一個sample情況下，可用flowcell+lane序號表示；SM表示sample名；LB表示原始測序文庫名；PL表示測序平臺
2.2 alignment section（required）
- alignment section是sam的主體部分，其中那個每行代表一次比對結果，以及對應詳細的比對信息。
-
如下圖，每條alignment record可分為9大部分，11+n列(metadata不固定)
alignment record
第一列：read name
在雙端測序，一般至少有兩條相同記錄的read name（pair reads），但有時會有很多條(>2)記錄是因為
- 首先是
Chimeric alignment情況，就是類似最一開始介紹的r003的比對情況，由于序列的特性，可能比對到不同的比較合適區域； - 然后是
Multiple mapping情況，這主要是由于reads序列與基因組的重復序列特征導致的（在人基因組中約占20%）。
read name
第二列：flag
- 簡單來說就是設置該條reads的比對屬性；
- 表示某條reads是否有12條特征中的1至多條(多選題)，結果用10進制數值加和表示
image.png
簡單理解所有選項含義---
1表示是雙端測序；
2表示pair reads均比對到了參考序列(good!)
4表示這條read沒比對到參考序列
8表示這條read的mate read沒比對到參考序列
16表示這條read是reverse(反向)比對到參考序列的
32表示這條read的mate read是reverse(反向)比對到參考序列的'
64表示這條read是pair read的第一條read(左邊的)
128表示這條read是pair read的第二條read(右邊的)
256表示是這條read的Multiple mapping reads比對情況
其余三種情況比較少見，不作記錄了。關于secondary alignment與supplementary alignment的區別我認為就是分別對應Multiple mapping reads與Chimeric alignment比對情況。詳見https://sourceforge.net/p/samtools/mailman/message/33235303/
- 某一加和結果數值只會是一組屬性特征值的和，不會出現不同組合均能加和等于一個特定和的結果；
- 例如下圖，具體flag值含義參考上面解釋
113=1+16+32+64
369=1+16+32+64+256
117=1+16+32+128
417=1+32+128+256
image.png
這個網頁https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html提供了根據輸入的結果flag來分解原特征組合的功能，挺方便的。
第三列&第四列：read的位置
- RNAME: Reference sequence NAME of the alignment；與header部分的
@SQ SN保持一致； - POS: read比對到參考序列(染色體)的最左邊位置(基于染色體，且為1-based)；
- 如果只有pairs reads的一個成功比對到參考序列，那么未比對的reads的
RNAME與POS應與比對上的reads的描述一致； - 如果pair reads均未成功比對到參考序列上，則RNAME列均為
*，POS列均為0
unmapped reads
簡單來說1-based就是序列第一個堿基序號為1，例如SAM, VCF, GFF and Wiggle formats等；0-based就是序列第一個堿基序號為0，例如 BAM, BCFv2, BED, and PSL formats等。
第五列：MAPQ
- MAPping Quality. It equals ?10log 10 Pr{mapping position is wrong}, rounded to the nearest
integer. - 一般來說MAPQ值越大，表示MAPping Quality越高；但255表示不可計算該read的MAPQ(我理解就是指unmapped的reads)
第六列：CIGAR
- 這一列主要來描述序列的具體比對情況，以堿基為單位，主要有如下圖幾種比對類型
image.png
M表示read堿基比對到了參考序列的堿基上(有趣的是允許夾雜mismatch的情況，為SNP variant calling基礎)
I相比于參考序列，read里插入insert了新堿基
D相比于參考序列，read里刪除了部分堿基
N比較特殊一般用于mRNA-seq結果里，表示比對到了intron內含子區域；
S/H表示read序列兩端基本沒能比對到參考序列，而中間部分可以比對的情況；具體區別可參考http://www.aigenetic.com/index.php/2018/03/19/soft-clip-%E4%B8%8E-hard-clip%E7%9A%84%E5%90%AB%E4%B9%89%E6%8F%8F%E8%BF%B0/
P針對是多條reads比對到同一參考序列區域，其中有一條reads存在insert的情況，具體見https://davetang.org/wiki/tiki-index.php?page=SAM#Padded_alignment - Sum of lengths of the
M/I/S/=/Xoperations shall equal the length of SEQ，其中=X不常見。并且第四列read的起始位置也是從M/I/S/=/X開始計算的
其實總結來看，
N與S/H分別表示了兩種特殊比對情況spliced alignment與clipped alignment，前者是中間沒比對上，而兩端比對上了；后者使中間比對上，而兩端沒比對上。
clipped alignment -- 3S8M1D6M4S
spliced alignment -- 9M32N8M
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舉個例子，如下圖表示3 bases aligned followed by 1 base deleted, 2 next ones aligned, 1 base inserted and the last one aligned.
image.png
第七、八、九列：描述mate read信息
- RNEXT是該read的mate read比對到的參考染色體，有三種情況；
（1）=：read與mate read比對到同一染色體上；
（2）若mate read比對到其它染色體上，則用相應的染色體名稱即可（SN）
（3）若mate read未比對成功，用*表示 - PNEXT是該read的mate read比對到的參考染色體的起始位置；
- TLEN列主要描述pair reads的"相隔距離"，如下圖。
（1）僅考慮M/I/=/X(excludes soft-clipped bases)情況；
（2）pair reads的該列絕對值相同，只是左邊的reads為正值，右邊的reads為負值；
（3）如果pair reads分別比對到不同染色體上，那么該值就是0
image.png
特殊的TLEN：Note: these two definitions agree in most alignments, but differ in the case of overlaps where the first segment aligns beyond the start of the last segment.
image.png
第十、十一列：序列信息
- 第十列：原始序列組成，等于原來fastq的第二行；
- 第十一列：序列的Phred質量值，等于原來fastq的第四行；詳見之前fastq的筆記。
第12+n列：metadata（optimal）
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TAG:TYPE:VALUE格式：TAG表示標簽名，一般是兩個大寫字母；TYPE表示VALUE的數據類型；VALUE表示該read的VALUE值 - Predefined standard tags可參考：https://samtools.github.io/hts-specs/SAMtags.pdf
- 以
BWA mem比對結果產生的TAG結果為例，解釋如下圖。
image.png
至此，關于sam格式的基本介紹大致如上，主要參考了http://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf教程手冊，其中還有很多深入的知識，值得以后深入探索~~
三、samtools轉換sam、bam
- sam轉bam
samtools view -bS SRR1663608.sam > SRR1663608.bam
- bam轉sam
samtools view -h -o SRR1663608.sam SRR1663608.bam
- bam結果統計
#查看bam
samtools view -h SRR1663608.bam | more
#the number of records (alignments)
samtools view -c SRR1663608.bam
#Displays basic alignment stats based on flag
samtools flagstat SRR1663608.bam
更多關于sam/bam格式的操作，可見之間生信技能樹Jimmy大神布置的一些練習題，我自己也做了，詳見Linux生信練習3--sam/bam
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