Week24 — 人類原發(fā)性腫瘤的染色質(zhì)可及性圖譜-01: 主要回顧了ATAC-seq方法的原理和優(yōu)點(diǎn)，并與其他研究染色質(zhì)可及性方法的比較，然后介紹了這篇文章的主要結(jié)果和亮點(diǎn)以及提供的數(shù)據(jù)資源。
Week25 — 人類原發(fā)性腫瘤的染色質(zhì)可及性圖譜-02：介紹了文章思路和主要結(jié)果。
這篇文章主要了解下補(bǔ)充材料的分析方法。
1. ATAC-seq數(shù)據(jù)預(yù)處理和比對(duì)
ATAC-seq預(yù)處理和比對(duì)使用的是PEPATAC pipeline(http://code.databio.org/PEPATAC/)。
PEPATAC pipeline是一個(gè)打包的ATAC-seq數(shù)據(jù)預(yù)處理流程，包括對(duì)原始數(shù)據(jù)的去接頭、比對(duì)、call peak、創(chuàng)建bigwig、TSS富集文件等其他一些統(tǒng)計(jì)結(jié)果文件。
輸出的圖如：
具體包括：
- Bowtie2 比對(duì)，移除比對(duì)到chrM和重復(fù)序列
-k 1 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50 -X 2000 –rg-id # remove repeats的參數(shù)
--very-sensitive -X 2000 --rg-id # bowtie2參數(shù)
- 排序去除重復(fù)
使用Picard 的MarkDuplicates去除重復(fù)。
-f 2 -q 10 -b -@ 20 # 排序參數(shù)
VALIDATION_STRINGENCY =LENIENT REMOVE_DUPLICATES = true #去重參數(shù)
2. call peaks(MACS2)
這里他們選用固定寬度（fixed-width）的peaks,優(yōu)點(diǎn)有：1）對(duì)大量的peaks進(jìn)行counts和motif分析時(shí)可以減小誤差；2）對(duì)于大量數(shù)據(jù)集的可以合并峰得到一致性的peaks;
使用的是macs2 call peaks,參數(shù)如下：
--shift -75 --extsize 150 --nomodel --call-summits --nolambda --keep-dup all -p 0.01
同時(shí)根據(jù)hg38 blacklist過濾，并除去染色體兩端以外的峰。
一個(gè)樣本的overlaps他們是通過迭代移除的方法，首先保留最顯著的peak,然后任何與最顯著peak有直接overlap的peaks都被移除；接著對(duì)另一個(gè)最顯著性的peak進(jìn)行相同的操作，最終保留所有更顯著的peaks，移除與其有直接overlaps的peaks。
3. ATAC-seq數(shù)據(jù)分析—— 構(gòu)建counts矩陣并標(biāo)準(zhǔn)化
為了獲得每個(gè)峰中獨(dú)立的Tn5插入的數(shù)量，首先用RRsamtools “scanbam”對(duì)BAM文件矯正Tn5偏移量（“+” stranded +4 bp, “-” stranded -5 bp）并存入Genomic Ranges對(duì)象。然后用“countOverlaps”對(duì)矯正后的插入位點(diǎn)計(jì)數(shù)，最終得到 562,709 x 796 counts 矩陣。
counts矩陣用edgeR “cpm(matrix , log = TRUE,prior.count = 5)”標(biāo)準(zhǔn)化，然后用R中的preprocessCore’s “normalize.quantiles”做分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。
4. ATAC-seq data analysis – Transcription factor footprinting
TF足跡的分析：
一是參考了文章doi: 10.1016/j.celrep.2017.05.003：
- 首先確定peaks內(nèi)的TF motif的位置，用pan-cancer peak set 結(jié)合CIS-BP motifs計(jì)算motif的位置，
motifmatchr “matchMotifs(positions = “out”) - 然后計(jì)算
flanking accessibility和footprint depth - 最后確定哪個(gè)TF的足跡與基因的表達(dá)是顯著相關(guān)
通過將flanking accessibility or footprint depth與250個(gè)隨機(jī)的TFs的關(guān)聯(lián)分析生成零均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
5. ATAC-seq data analysis – chromVAR for transcription factor activity
除了足跡分析，他們還用chromVAR包評(píng)估TF的活動(dòng)，首先用chromVAR deviations函數(shù)計(jì)算GC矯正偏差，然后將矯正偏差與motif相關(guān)的TFs關(guān)聯(lián)，最后5000個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基序和非相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的RNA-seq基因表達(dá)之間的隨機(jī)相關(guān)性，以計(jì)算每個(gè)相關(guān)性的FDR。具體參考：Week4— chromVAR:預(yù)測(cè)染色質(zhì)可及性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子
6. ATAC-seq data analysis – chromVAR for GWAS enrichment
- 首先從GWAS catalog（https://www.ebi.ac.uk/gwas/docs/file-downloads）下載SNPs位點(diǎn)，過濾和16種癌癥類型相關(guān)的SNPs位點(diǎn)。
- 加上連鎖不平衡（Linkage Disequilibrium ，LD) 信息（ r 2 > 0.8）
LD信息從haploreg 網(wǎng)站下載 http://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/data/ - 移走位于exons或UTR區(qū)域的SNPs位點(diǎn)，得到最后的SNP列表
- 將最后的SNP列表與遠(yuǎn)端 binarization peak 集overlap，得到一個(gè)二元匹配矩陣。每列代表不同癌癥癌癥類型的GWAS SNP，每行代表一個(gè)peak，這個(gè)peak來自遠(yuǎn)端 binarization peak 集。
- 用chromVAR
deviations函數(shù)計(jì)算GC矯正偏差 - 用
PNAMER將“偏差分?jǐn)?shù)”轉(zhuǎn)換為p值，并使用Bejimi-HocHBG程序調(diào)整
