疫情當前，我們延緩了返校，延緩了復工，但絲毫沒有阻擋我們追求上進的心。居家隔離的日子，各個公司爭相推出滿滿的線上培訓課表，雖然進不了實驗室，但是大腦被這知識盛筵喂得飽飽的。而最受歡迎的，莫過于空間轉錄組的培訓，動輒就上千人，而且大家的提問也很熱烈，充分顯示了科研工作者對這項剛推出不久的新技術的濃厚興趣。今天，就帶大家全面了解一下這項新技術——Visium?空間轉錄組測序。
為什么要做空間轉錄組呢？我們從下圖案例中就可直觀感受到。如果使用單細胞測序，A和B兩個樣本可能分析出來的細胞亞群是一樣的，但事實上，A病人的預后效果就比B病人好，因為他的淋巴細胞使均勻地浸潤在組織中，而B病人的淋巴細胞被腫瘤阻擋在外面。空間轉錄組測序就能很好地解釋這一預后差異。
一、實驗流程
單細胞轉錄組測序相信大家都不陌生了，它是將組織里的細胞打散制備成單細胞懸液，很多老師就遺憾，這樣就不能知道細胞的空間位置信息了。單細胞功能不僅僅是由細胞本身哪些基因是否活躍來定義的，組織在組織樣本中的位置也同樣重要。而現在，空間轉錄組技術就解決了這一技術難題，只需提供H&E染色的切片，就可得到切片相應位置的基因表達信息，將傳統組織學技術的優勢與RNA測序的高通量特點相結合，在組織中呈現基因表達空間分辨率水平的可視化信息。看一下實驗流程，就可知道這一目標是怎樣實現的了。
將新鮮冷凍的組織切片，置于文庫制備載玻片上，經過固定，染色和透化后，釋放出mRNA，mRNA與空間條形碼捕獲探針相結合，從而捕獲基因表達信息。然后將捕獲的mRNA合成cDNA并制備測序文庫。測序后，對數據進行可視化分析。從樣品到文庫制備的工作流程可在1天內完成。
二、技術原理
空間基因表達解決方案技術核心在于載玻片部分，用于文庫構建的每張載玻片上有四個捕獲區域（6.5x6.5mm，玻片上四個方框），每個捕獲區域含有5000個被條形碼標記的點（barcoded spots，下圖中顏色不同的彩色圓點），直徑為55μm，（兩點之間中心的距離為100μm），每個點都有一個獨特的條形碼序列（下圖毛毛蟲第二段綠色的Spatial?Barcode），每個點中的每條毛毛蟲上的UMI都不同，用以區別同一細胞的不同轉錄本并去除PCR?Duplications，實現絕對定量。當RNA從組織切片的細胞中釋放出來后，遷移到每個點的RNA會被標記上相應的條形碼序列，然后進行文庫構建并進行測序。接下來，根據數據的條形碼信息對數據進行分配，以確定哪些數據來自哪個位置。最終實現空間基因表達的可視化。我們來放大載玻片看一下。
這里要特別提一下樣本制備，不能直接用液氮速凍的組織，急速降溫會導致細胞損傷，10X官方建議使用OTC包埋的異戊烷速凍組織。多少老師單細胞實驗卡在懸液制備這一步了，多次消化還是得不到符合上機要求的單細胞懸液，而即使勉強上機，也面臨著細胞狀態不好，捕獲到的細胞數目過少，甚至多細胞的風險。但空間轉錄組就簡單多了，冷凍好組織（最好在有經驗的公司指導下操作），后面的組織透化摸索、染色、固定、透化、建庫、測序、分析等等步驟，統統丟給公司做吧，節省下來的時間來讀讀文獻，思考一下怎么寫基金，申請實驗經費。
三、適用范圍
該方案廣泛適用于癌癥、腫瘤免疫學、神經科學、發育生物學等領域的研究。
目前已測試過如下組織類型*：
·?人：心臟、腎臟、卵巢、乳房、淋巴結
·?小鼠：脂肪、腦、小腸、胃、肝臟、大腦、四頭肌、肺、睪丸、甲狀腺、眼睛、舌頭、大腸、脾臟、乳腺
·?大鼠：腦、腎臟、心臟
*此表僅列出了目前為止經過測試的樣本類型，更多兼容樣本類型更新請參考10x Genomics官方網站
四、結果展示
Visium空間基因表達解決方案數據展示：
A. H＆E染色小鼠冠狀腦組織切片；基因Selenow（B）和基因Tmsb4x（C）的空間mRNA表達為大腦中已知的表達模式，主要在海馬體中表達。圖中結果顯示了這兩個基因在海馬體中有顯著表達，并且與已知的表達模式一致（注意：點大小不是按比例縮放）。
10X?Genomics提供給科研工作者免費的空間轉錄組測序分析軟件：Space Ranger?和Loupe?Browser。Space Ranger實現自動處理數據和圖像；根據基因表達分析亞群；數據質控。Loupe?Browser和單細胞的loupe一樣，實現空間基因表達數據的可視化，用戶交互體驗滿足個性化分析需求。
五、案例分析
下圖是10X?官方列出的已發表的空間轉錄組的文章。
???我們來看一下Cell上一篇關于人類心臟發育的空間基因表達和細胞圖譜的文章：A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart。
文章利用單細胞測序技術以及空間轉錄組測序技術繪制了人類心臟發育的基因表達，構建了3D器官基因表達圖譜。研究亮點：描述了人類心臟基因的時空表達模式；分析了人類胚胎心臟細胞類型的分布和空間組織；深入分析了不同細胞類型在心臟發育中的作用；創建了可供使用的人類胚胎心臟網絡資源。
空間轉錄組：本研究取了三個時間段，4.5-5；6.5-7；9周的人類心臟共19張切片做了空間轉錄組分析，共得到10個亞群，并將這些亞群映射回組織切片對應位置，發現三個時期中都有clusters 0, 1, 2, 3, and 4 (myocardial regions)；與其他兩個時期相比，4.5–5個PCW組織中的OFT和larger vessels（cluster 5）不明顯，主要表現為AV mesenchyme（cluster 6）。如下圖所示。
單細胞轉錄組：研究人員選取了6.5-7周的樣本（分為上下兩部分）做了單細胞轉錄組，采用了10X?Genomics Chromium workstation。（為什么還要再做一個單細胞轉錄組呢？因為作者做的空間轉錄組分辨率不能達到單細胞水平，一個spot中大約有30個細胞。推薦老師們們有需要的時候也加上一個單細胞轉錄組，提高細胞分辨率）。研究人員選取了另外一份6.5-7周的心臟作為對應空間轉錄組實驗的樣本的生物學重復（大概是切過10片切片之后不夠做單細胞了），并計算了兩者的相關性，r=0.93來證明用另一份樣本做生物學重復的合理性。最后得到15個亞群，并根據maeker gene的表達定義了這些亞群，更多的亞群集中在心臟上半部分，顯示了心臟上部有豐富的細胞多樣性。見下圖。
????綜合空間轉錄組和單細胞轉錄組的結果，作者最終篩選出來69個基因作一個panel，通過這69個基因就能回溯到原始的cluster中。作者還做了Rolling circle amplification (RCA) and in situ sequencing (ISS)?和Single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH)作為驗證，感興趣的老師可以去看原文。
????了解了基本原理，老師們可以想想怎么把這個新技術運用到自己的研究中，解決我們科研中的問題。
