細胞治療采用生物工程的方法獲取具有特定功能的細胞并通過體外擴增、特殊培養等處理后，使這些細胞具有增強免疫、殺死病原體和腫瘤細胞等功能，從而達到治療某種疾病的目的。目前主要的細胞治療方式為免疫細胞治療和干細胞治療，經過一段時間的發展，CAR-T細胞療法已成為免疫細胞治療中的熱點。CyTOF技術作為最前沿的單細胞蛋白檢測技術在CAR-T細胞治療中具有不可替代的關鍵性作用，接下來分享三篇近期CAR-T細胞治療中應用CyTOF技術取得的重要成果。
短暫休息逆轉 CAR-T 細胞耗竭（IF=47.73）
因抗原的過度刺激或 CAR-T 細胞自發信號而導致 CAR-T 細胞耗竭是影響 CAR-T 療效的一個原因。由美國斯坦福大學醫學院Crystal L. Mackall教授團隊構建一個可以人為操控“開”和“關”的 CAR-T 細胞，將 CAR-T 結合去穩定結構域（DD），以此調控 CAR 的表達。DD 在沒有配體的情況下快速降解 CAR 的表達，而在加入配體后，穩定的 DD 會穩定表達 CAR，恢復 CAR 的信號。
透過 DD. CAR 的系統，研究人員探究短暫“關閉”CAR 信號可否增強 CAR-T 細胞的功能。在移植白血病細胞及 DD. CAR 細胞的 NSG 小鼠中，短暫阻斷 CAR 信號(ON/FF)組相較于持續開啟的 CAR-T (ON/ON) 及一直處于“關閉”狀態的 CAR-T 細胞組 (OFF/OFF)，具有更好抑制腫瘤生長的效果。隨后研究人員通過 CyTOF 技術進一步發現短暫阻斷 CAR 信號除了可以逆轉 CAR-T 細胞耗竭，還可以增加記憶型 CAR-T。結果顯示耗竭的 CAR-T 細胞在短暫阻斷其 CAR 信號 4 天后，不僅可以逆轉其耗竭表型，還可以誘導轉錄重編程和整體表觀遺傳重構，達到和未耗竭的 CAR-T 對照組相似的水平[1]。
CAR-T 細胞與白血病的抗癌反應和長期緩解相關的特征（IF=49.97）
重編程以靶向腫瘤細胞的 T 淋巴細胞的過繼轉移已證明具有治療各種癌癥的潛力，CAR-T 細胞在 ALL 和 CLL 中的功能持久性是持久臨床反應的關鍵特征。然而，人們對注入細胞的長期潛力和克隆穩定性知之甚少。
近期，賓夕法尼亞大學、費城兒童醫院、諾華生物醫學研究所等團隊的研究人員在頂級學術期刊《Nature》上發表了在 2010 年實現完全緩解的兩名 CLL 患者的長效 CD19 重定向CAR-T 細胞的分析結果，解釋了CAR-T 細胞療法記錄到目前為止對 CLL 的最長持續時間，并顯示 CAR-T 細胞在輸注到患者體內后至少十年仍可檢測到。研究人員利用 CyTOF 通過 40 個蛋白 marker 對兩名患者不同時間段的 CAR-T 細胞進行分析，發現患者的 CAR-T 細胞治療反應有兩個主要階段：以 CD8+ T 細胞和 CD4-CD8- Helioshi CAR-T細胞為代表的初始反應階段；以及由 CD4+ CAR-T 細胞占主導優勢的長期緩解階段，這些細胞繼續表現出腫瘤細胞殺傷特性和持續的增殖。研究發現其中一個患者在 9.3 年檢測到的 CAR-T 細胞僅為 CD4+，這表明 CD4+ T細胞可能是對 CD19 表達細胞的細胞毒性的主要原因。研究人員認為對這些 CAR-T 細胞群的鑒定和表征為與抗癌反應和白血病長期緩解相關的 CAR-T 細胞特征提供了新的見解[2]。
PD-1 抗體與 CAR-T 細胞聯用效果分析（IF=22.11）
盡管許多患者經過 CAR-T 療法后疾病獲得緩解，但只有 30-40% 的大B細胞淋巴瘤患者和約 60% 的濾泡性淋巴瘤患者取得長期緩解。在 CAR-T 細胞治療失敗的患者中，腫瘤細胞或腫瘤微環境的免疫檢查抑制點蛋白（PD-L1、LAG3）的基線表達水平更高。研究人員觀察到臨床上一些 CAR-T 細胞治療后進展的淋巴瘤患者，在使用免疫檢查點抑制劑時，可以產生療效反應。
因此，賓夕法尼亞大學醫學院研究人員提出了使用 PD-1 抗體可以逆轉 CAR-T 細胞治療后 T 細胞耗竭的假說，開展了一項帕博利珠單抗用于 CD19 CAR-T 治療后復發/難治性B細胞淋巴瘤患者的臨床試驗。為了評估治療過程中與臨床療效潛在相關的生物標志物，研究人員使用 CyTOF 分析了基線和 CAR-T 細胞擴增峰值時 PBMC 中 CAR-T 細胞的比例、CAR-T 細胞和非 CAR-T 細胞的不同分化特征以及有臨床療效和沒有療效患者的 CAR-T 細胞和非 CAR-T 細胞的特征，結果表明 CAR-T 細胞輸注后使用帕博利珠單抗是安全的且耐受良好，并在一部分患者中產生了臨床療效。有療效的患者在帕博利珠單抗給藥后，CAR-T 細胞活化和增殖增加，并且耗竭程度較低[3]。
盡管 CAR-T 已經展現出了治療實力，奠定了其突破性地位，但現有的 CAR-T 治療中出現了很多問題。很多患者出現了細胞因子風暴、神經毒性、過敏等不良反應；有的患者使用?CAR-T 治療后很快就復發；還有的甚至對?CAR-T 治療沒有反應。
CyTOF 技術是一種高通量單細胞蛋白質分析技術，利用金屬元素作為抗體的標簽，以質譜作為檢測手段，可同時分析單細胞表面和內部的 50 多種標志物，可對患者體內 CAR-T 細胞表型和功能進行深入而細致的分析，探索產生不良反應、治療復發以及治療無效的原因，監測免疫細胞動態，從而實現靶向治療。
【參考文獻】
[1] Weber EW, Parker KR, Sotillo E, et al. Transient restrestores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling.Science. 2021
[2] Melenhorst JJ, Chen GM, Wang M, et al.Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells. Nature.2022
[3]Chong EA, Alanio C,Svoboda J, et al. Pembrolizumab for B-cell lymphomas relapsing after orrefractory to CD19-directed CAR T-cell therapy. Blood. 2021
