原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/p-4-WerJ6m2F9b5Ie-cerA

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? WGCNA和差異基因分析（DEG）的差異在于DEG主要分析樣本和樣本之間的差異，而WGCNA主要分析的是基因和基因之間的關(guān)系。WGCNA通過分析基因之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，將基因區(qū)分為多個(gè)模塊。而最后通過這些模塊和樣本表型之間的關(guān)聯(lián)性分析，尋找特定表型的分子特征。

網(wǎng)上例子千千萬(wàn)，但是大部分都是從文檔翻譯而來，要用起來還是有些費(fèi)勁，要深入的可以移步這里：http://www.stat.wisc.edu/~yandell/statgen/ucla/WGCNA/wgcna.html

下面我將根據(jù)TCGA乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及乳腺癌壓型數(shù)據(jù)，一步一步的使用WGCNA來進(jìn)行乳腺癌各個(gè)亞型共表達(dá)模塊的挖掘

#############數(shù)據(jù)準(zhǔn)備#############

首先我們需要下載TCGA 的乳腺癌的RNA-seq數(shù)據(jù)以及臨床病理資料，我這里使用我們自己開發(fā)的TCGA簡(jiǎn)易下載工具進(jìn)行下載

首先下載RNA-Seq：

下載之后共得到1215個(gè)樣本表達(dá)數(shù)據(jù)

進(jìn)一步下載臨床病理資料

進(jìn)一步點(diǎn)擊

ClinicalFull按鈕對(duì)病理資料進(jìn)行提取得到ClinicalFull_matrix.txt文件，使用Excel打開ClinicalFull_matrix.txt文件可以看到共有301列信息，包含了各種用藥，隨訪，預(yù)后等等信息，我們這里選擇乳腺癌ER、PR、HER2的信息，去除其他用不上的信息，然后選擇了其中有明確ER、PR、HER2陽(yáng)性陰性的樣本，隨機(jī)拿100個(gè)做例子吧

樣本篩選完了，現(xiàn)在輪到怎么獲取這些樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)啦，前面下載了一千多個(gè)樣本的RNA-seq,從里面找到這一百個(gè)樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)其實(shí)也是不需要變成的啦，看清楚咯

首先打開RNA-Seq數(shù)據(jù)目錄的fileID.tmp(用Excel打開)，然后可以看到兩列：

將第二列復(fù)制，并且替換-01.gz為空

使用Excel的vlookup命令將臨床病理資料的那100個(gè)樣本進(jìn)行映射

然后篩選非N/A的就得到了這一百個(gè)樣本對(duì)于的RNA-seq數(shù)據(jù)信息

進(jìn)一步刪除其他的樣本，還原成fileID.tmp格式保存退出：

然后使用TCGA簡(jiǎn)易小工具“合并文件”按鈕就得到表達(dá)矩陣了，進(jìn)一步使用ENSD_ID轉(zhuǎn)換按鈕就得到了基因表達(dá)矩陣和lncRNA表達(dá)矩陣了

#################R代碼實(shí)現(xiàn)WGCNA##############

setwd('E:/rawData/TCGA_DATA/TCGA-BRCA')

samples=read.csv('ClinicalFull_matrix.txt',sep = '\t',row.names = 1)

dim(samples)

#[1] 100 ? 3

expro=read.csv('Merge_matrix.txt.cv.txt',sep = '\t',row.names = 1)

dim(expro)

#[1] 24991 ? 100

數(shù)據(jù)讀取完成，從上述結(jié)果可以看出100個(gè)樣本，有24991個(gè)基因，這么多基因全部用來做WGCNA很顯然沒有必要，我們只要選擇一些具有代表性的基因就夠了，這里我們采取的方式是選擇在100個(gè)樣本中方差較大的那些基因（意味著在不同樣本中變化較大）

繼續(xù)命令：

m.vars=apply(expro,1,var)

expro.upper=expro[which(m.vars>quantile(m.vars, probs = seq(0, 1, 0.25))[4]),]##選擇方差最大的前25%個(gè)基因作為后續(xù)WGCNA的輸入數(shù)據(jù)集

通過上述步驟拿到了6248個(gè)基因的表達(dá)譜作為WGCNA的輸入數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步的我們需要看看樣本之間的差異情況

datExpr=as.data.frame(t(expro.upper));

gsg = goodSamplesGenes(datExpr, verbose = 3);

gsg$allOK

sampleTree = hclust(dist(datExpr), method = "average")

plot(sampleTree, main = "Sample clustering to detect outliers"

, sub="", xlab="")

從圖中可看出大部分樣本表現(xiàn)比較相近，而有兩個(gè)離群樣本，對(duì)后續(xù)的分析可能造成影響，我們需要將其去掉，共得到98個(gè)樣本

clust = cutreeStatic(sampleTree, cutHeight = 80000, minSize = 10)

table(clust)

#clust

#0 ?1

#2 98

keepSamples = (clust==1)

datExpr = datExpr[keepSamples, ]

nGenes = ncol(datExpr)

nSamples = nrow(datExpr)

save(datExpr, file = "FPKM-01-dataInput.RData")

得到最終的數(shù)據(jù)矩陣之后，我們需要確定軟閾值，從代碼中可以看出pickSoftThreshold很簡(jiǎn)單，就兩個(gè)參數(shù)，其他默認(rèn)即可

powers = c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))

sft = pickSoftThreshold(datExpr, powerVector = powers, verbose = 5)

##畫圖##

par(mfrow = c(1,2));

cex1 = 0.9;

plot(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],

xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",type="n",

main = paste("Scale independence"));

text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],

labels=powers,cex=cex1,col="red");

abline(h=0.90,col="red")

plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5],

xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Mean Connectivity", type="n",

main = paste("Mean connectivity"))

text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], labels=powers, cex=cex1,col="red")

從圖中可以看出這個(gè)軟閾值選擇7比較合適,選擇軟閾值7進(jìn)行共表達(dá)模塊挖掘

pow=7

net = blockwiseModules(datExpr, power = pow, maxBlockSize = 7000,

TOMType = "unsigned", minModuleSize = 30,

reassignThreshold = 0, mergeCutHeight = 0.25,

numericLabels = TRUE, pamRespectsDendro = FALSE,

saveTOMs = TRUE,

saveTOMFileBase = "FPKM-TOM",

verbose = 3)

table(net$colors)

# open a graphics window

#sizeGrWindow(12, 9)

# Convert labels to colors for plotting

mergedColors = labels2colors(net$colors)

# Plot the dendrogram and the module colors underneath

plotDendroAndColors(net$dendrograms[[1]], mergedColors[net$blockGenes[[1]]],

groupLabels = c("Module colors",

"GS.weight"),

dendroLabels = FALSE, hang = 0.03,

addGuide = TRUE, guideHang = 0.05)

從圖中可以看出大部分基因在灰色區(qū)域，灰色部分一般認(rèn)為是沒有模塊接受的，從這里也可以看出其實(shí)咱們選擇的這些基因并不是特別好

那么做到這一步了基本上共表達(dá)模塊做完了，每個(gè)顏色代表一個(gè)共表達(dá)模塊，統(tǒng)計(jì)看看各個(gè)模塊下的基因個(gè)數(shù)：

那么得到模塊之后下一步該做啥呢，或許很多人到這就不知道如何繼續(xù)分析了

這里就需要咱們利用這些模塊搞事情了，舉個(gè)例子

如果你是整合的數(shù)據(jù)（整合lnc與gene），那么同時(shí)在某個(gè)模塊中的基因和lncRNA咱們可以認(rèn)為是 共表達(dá)的，這便是lnc-gene共表達(dá)關(guān)系的獲得途徑之一了，進(jìn)一步你可以根據(jù)該模塊的基因-lnc-基因之間的關(guān)系繪制出共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

今天咱們這里不講這個(gè)，而是跟表型關(guān)聯(lián)，咱們已經(jīng)拿到了這98個(gè)樣本的ER、PR、HER2陽(yáng)性陰性信息，那么進(jìn)一步的咱們可以看看哪些共表達(dá)模塊跟ER、PR、HER2陰性最相關(guān)，代碼如下：

moduleLabelsAutomatic = net$colors

moduleColorsAutomatic = labels2colors(moduleLabelsAutomatic)

moduleColorsFemale = moduleColorsAutomatic

MEs0 = moduleEigengenes(datExpr, moduleColorsFemale)$eigengenes

MEsFemale = orderMEs(MEs0)

samples=samples[match(row.names(datExpr),paste0(gsub('-','.',row.names(samples)),'.01')),]#匹配98個(gè)樣本數(shù)據(jù)

trainDt=as.matrix(cbind(ifelse(samples[,1]=='Positive',0,1),#將陰性的樣本標(biāo)記為1

ifelse(samples[,2]=='Positive',0,1),#將陰性的樣本標(biāo)記為1

ifelse(samples[,3]=='Positive',0,1),#將陰性的樣本標(biāo)記為1

ifelse(samples[,1]=='Negative'&samples[,2]=='Negative'&samples[,3]=='Negative',1,0))#將三陰性的樣本標(biāo)記為1

)#得到一個(gè)表型的0-1矩陣

modTraitCor = cor(MEsFemale, trainDt, use = "p")

colnames(MEsFemale)

modTraitP = corPvalueStudent(modTraitCor, nSamples)

textMatrix = paste(signif(modTraitCor, 2), "\n(", signif(modTraitP, 1), ")", sep = "")

dim(textMatrix) = dim(modTraitCor)

labeledHeatmap(Matrix = modTraitCor, xLabels = colnames(trainDt), yLabels = names(MEsFemale),

ySymbols = colnames(modlues), colorLabels = FALSE, colors = greenWhiteRed(50),

textMatrix = textMatrix, setStdMargins = FALSE, cex.text = 0.5, zlim = c(-1,1)

, main = paste("Module-trait relationships"))

最終找到幾個(gè)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與三陰性表型最相關(guān)的模塊。

到了這一步其實(shí)還沒完，咱們已經(jīng)拿到了最相關(guān)的模塊比如上圖中的yellow模塊，那么yellow模塊中的基因，哪些基因最重要，我們?cè)撊绾潍@取

首先我們需要計(jì)算每個(gè)基因與模塊的相關(guān)關(guān)系

modTraitCor = cor(MEsFemale, datExpr, use = "p")

modTraitP = corPvalueStudent(modTraitCor, nSamples)

corYellow=modTraitCor[which(row.names(modTraitCor)=='MEyellow'),]

head(corYellow[order(-corYellow)])

#RAD51AP1 ? ? HDAC2 ? ? FOXM1 ? ?NCAPD2 ? ? ?TPI1 ? ? ?NOP2

#0.9249354 0.9080872 0.8991733 0.8872607 0.8717050 0.8708449

從上訴結(jié)果中可以看出RAD51AP1,HDAC2兩個(gè)基因與yellow相關(guān)性最好，也就是說這兩個(gè)基因是yellow模塊的hub-gene

進(jìn)一步的咱們導(dǎo)出yellow模塊的基因共表達(dá)關(guān)系使用cytoscape進(jìn)行可視化，代碼如下：

TOM = TOMsimilarityFromExpr(datExpr, power = pow);

probes = names(datExpr)

mc='yellow'

mcInds=which(match(moduleColorsAutomatic, gsub('^ME','',mc))==1)

modProbes=probes[mcInds]

modTOM = TOM[mcInds, mcInds];

dimnames(modTOM) = list(modProbes, modProbes)

cyt = exportNetworkToCytoscape(modTOM,

edgeFile = paste("edges-", mc, ".txt", sep=""),

nodeFile = paste("nodes-", mc, ".txt", sep=""),

weighted = TRUE,

threshold = median(modTOM),

nodeNames = modProbes,

#altNodeNames = modGenes,

nodeAttr = moduleColorsAutomatic[mcInds]);

到此基本結(jié)束了，敲這么多字。。。。。。好累。。。。。

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