作者，Evil Genius
最近見到了很多研究者，真的是不把單細胞軌跡分析當回事，拿到樣本不定義直接跑monocle，這能對么？我看了都著急，基本理論要多多學習啊~~~，網上那么多教程，有甄別的看，不要盲目跑代碼。
單細胞個性化分析之軌跡分析篇
理論知識不是本篇重點，簡單介紹一下
軌跡分析主要基于以下3個步驟：
（1）基因篩選：尋找以“擬時”(即不只是嘈雜)方式變化的基因，并利用這些基因來構造數據。
（2）降低維度：一旦選擇了用于細胞排序的基因，就會對數據進行降維處理。
（3）pseudotime對細胞排序：通過將表達數據投影到較低維空間，構建細胞間的分化軌跡。
基因篩選
構建的軌跡分析首先是要選擇用于構建軌跡的基因，當然，選擇軌跡分析時用到的基因有很多方法。
（1）離散度高的基因（monocle自帶的方法，默認前1000）:缺點是a、基因是否與發育相關不清楚；b、不同細胞類型的發育選取的基因數量不可能一致；c、基因斷層（即基因并不是連續變化）；d、軟件并不能依據軌跡基因來判斷細胞是否具有多種分化路徑。
（2）Seurat[2]本身挑選高變基因的三種方法（vst、mean.var.plot、dispersion）:因為Seurat降維聚類的關系，Seurat選擇的高變基因也可以用于做軌跡分析，但缺點也很明顯a、基因是否與發育相關不清楚；b、不同細胞類型的發育選取的基因數量不可能一致；c、基因斷層；d、Seurat本身挑選的高變基因基于樣本整體，沒有分化關系的也納入了分析。
（3）如果背景很強，最好的解決方式是根據生物學背景選取發育的相關基因（例如采取多樣本、多時間點的策略推斷發育基因，a、對比不同時間相同細胞類型的基因變化關系。b、挑選表征分化關系的基因進行軌跡分析），缺點很明顯，難度特別大。
（4）尋找細胞類型之間具有連續變化的基因，理論上這是最優的選擇。
降低維度
降維方法除了在基礎分析篇提到的線性降維PCA與非線性降維TSNE、UMAP之外，針對軌跡分析會有獨特的降維方法。來了解一下軌跡分析軟件用到的主流降維方式。
最后定義軌跡
2022年9月發表于nature的文章MYB orchestrates T cell exhaustion and response to checkpoint inhibition為了研究多潛能的 TPEX cells, 專門進行流式分選該細胞類型，在細胞注釋的基礎之上，分析細胞的分化潛能，分析軟件Slingshot，人為指定軌跡的起點。
2022年8月發表于Nature Communications的文章Cellular taxonomy of Hic1+ mesenchymal progenitor derivatives in the limb: from embryo to adult也是專門研究間充質細胞（流式分選）的分化關系，分析軟件URD,這個軟件更夸張，不僅要人為指定時間的起點，還要指定發育的終點。
ScRNA-seq analyses define a mesenchymal cell progenitor hierarchy
2022年9月發表于Journal of experimental medicine的文章Helminth-induced reprogramming of the stem cell compartment inhibits type 2 immunity在做軌跡分析的時候，也是運用單細胞技術對epithelial lineage的細胞進行數據分析，定義的基礎上運用軟件Monocle3進行軌跡推斷，人為指定發育的起點。
2022年8月發表于Science Advances的文章RSPO2 defines a distinct undifferentiated progenitor in the tendon/ligament and suppresses ectopic ossification在做軌跡分析的時候，只對定義好的mesenchymal cell clusters進行軌跡推斷，軟件Monocle2，并且人為指定時間的起點。
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2022年8月發表于Cell Reports的文章Transcriptomics, regulatory syntax, and enhancer identification in mesoderm-induced ESCs at single-cell resolution，也是對ESCs進行軌跡分析，軟件monocle3，人為指定root。
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2022年8月發表于Kidney International的文章Urinary single-cell sequencing captures kidney injury and repair processes in human acute kidney injury也是在細胞注釋的基礎上，對kidney injury后的urinary tubular epithelial cells (TECs)進行軌跡分析（亞群軌跡分析），軟件monocle3，人為指定root。
2022年7月發表于Nature Communications的文章A brain precursor atlas reveals the acquisition of developmental-like states in adult cerebral tumours仍然是先定義，不過這次是把所有細胞納入進來軌跡分析，方法velocyto。
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但是真正在研究發育的時候，還是抽取有發育關系的細胞類型進行軌跡分析，分析方法URD。
2022年7月發表于Nature Communications的文章[Somatic cell fate maintenance in mouse fetal testes via autocrine/paracrine action of AMH and activin B也是針對有分化關系的細胞類型進行軌跡分析，分析軟件monocle3，人為指定發育root。
2022年7月發表于Nature Communications的文章Single-cell analysis highlights differences in druggable pathways underlying adaptive or fibrotic kidney regeneration也是針對GMM細胞類型的亞群進行軌跡分析，也需要人為指定時間root，分析軟件Slingshot。
2022年7月發表于Redox Biology的文章Dissecting the process of human neutrophil lineage determination by using alpha-lipoic acid inducing neutrophil deficiency model也是針對具體的細胞類型進行軌跡分析，軟件monocle2.
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2022年7月發表于Redox Biology的文章Nox4 promotes endothelial differentiation through chromatin remodeling也是一樣的，軟件SlingShot，人為指定root。
2022年7月發表于Cell Reports的文章 Mesenchymal-epithelial interaction regulates gastrointestinal tract development in mouse embryos也是針對具體的細胞類型進行軌跡分析，根據取樣時間確定root。
