作者，追風(fēng)少年i

隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展和相應(yīng)分析工具的大量出現(xiàn)，單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用逐漸走向成熟，能解決的生物學(xué)問(wèn)題也越來(lái)越廣泛。而其中，軌跡分析（擬時(shí)分析）是單細(xì)胞分析中重要的一環(huán)，細(xì)胞軌跡分析可以通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞間的變化軌跡來(lái)重塑細(xì)胞隨著時(shí)間的變化過(guò)程，幫助研究者從單細(xì)胞水平推斷細(xì)胞之間的演化及分化過(guò)程，尤其在組織發(fā)育、疾病免疫細(xì)胞演化方面的研究起到了至關(guān)重要的作用。

軌跡分析的分析基礎(chǔ)

擬時(shí)序分析，即根據(jù)不同細(xì)胞亞群基因表達(dá)量隨時(shí)間的變化情況，構(gòu)建細(xì)胞譜系發(fā)育，但這里的時(shí)間并不是真時(shí)間，而是一個(gè)虛擬的時(shí)間，是指的細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化和演替的順序和軌跡。機(jī)體為響應(yīng)各種應(yīng)激，其細(xì)胞會(huì)從一種功能“狀態(tài)”轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N功能“狀態(tài)”；當(dāng)細(xì)胞在不同狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變時(shí)，往往會(huì)經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄重組，導(dǎo)致一些基因被沉默，一些基因被重新激活，但純化這些瞬態(tài)細(xì)胞進(jìn)行研究是很困難或不可能的，而單細(xì)胞數(shù)據(jù)完美解決了這個(gè)問(wèn)題。理論上當(dāng)研究若干種細(xì)胞亞型，其潛在的細(xì)胞分化軌跡路徑有7種（如下圖）。包括環(huán)形（cycle）、線性（linear），分叉（bifurcation）、多分叉（Multifurcation）,樹型（Tree），以及更復(fù)雜的連接圖（相當(dāng)于樹結(jié)構(gòu)內(nèi)部又形成了回路）、分離圖（圖形連接中存在斷點(diǎn)）。

圖1 軌跡分化類型示意圖

其中通常做的單細(xì)胞或多樣本的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，軌跡分析大部分符合上圖第七種分化軌跡，即分離圖，但是軌跡分析的方法很多并不能識(shí)別這種具有多種分化軌跡的分化結(jié)果，典型如monocle^[1]，構(gòu)建的樹形圖會(huì)把免疫細(xì)胞和組織細(xì)胞混合在一起，這樣的結(jié)果明顯是錯(cuò)誤的。因而其實(shí)做軌跡分析最大的基礎(chǔ)，就是首先通過(guò)細(xì)胞注釋識(shí)別具有分化關(guān)系的細(xì)胞類型。

軌跡分析的主流分析思路

圖2 軌跡分析的示意圖

軌跡分析主要基于以下3個(gè)步驟：
（1）基因篩選：尋找以“擬時(shí)”(即不只是嘈雜)方式變化的基因，并利用這些基因來(lái)構(gòu)造數(shù)據(jù)。
（2）降低維度：一旦選擇了用于細(xì)胞排序的基因，就會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。
（3）pseudotime對(duì)細(xì)胞排序：通過(guò)將表達(dá)數(shù)據(jù)投影到較低維空間，構(gòu)建細(xì)胞間的分化軌跡。

基因篩選

構(gòu)建的軌跡分析首先是要選擇用于構(gòu)建軌跡的基因，當(dāng)然，選擇軌跡分析時(shí)用到的基因有很多方法。
（1）離散度高的基因（monocle自帶的方法，默認(rèn)前1000）:缺點(diǎn)是a、基因是否與發(fā)育相關(guān)不清楚；b、不同細(xì)胞類型的發(fā)育選取的基因數(shù)量不可能一致；c、基因斷層（即基因并不是連續(xù)變化）；d、軟件并不能依據(jù)軌跡基因來(lái)判斷細(xì)胞是否具有多種分化路徑。
（2）Seurat^[2]本身挑選高變基因的三種方法（vst、mean.var.plot、dispersion）:因?yàn)镾eurat降維聚類的關(guān)系，Seurat選擇的高變基因也可以用于做軌跡分析，但缺點(diǎn)也很明顯a、基因是否與發(fā)育相關(guān)不清楚；b、不同細(xì)胞類型的發(fā)育選取的基因數(shù)量不可能一致；c、基因斷層；d、Seurat本身挑選的高變基因基于樣本整體，沒(méi)有分化關(guān)系的也納入了分析。
（3）如果背景很強(qiáng)，最好的解決方式是根據(jù)生物學(xué)背景選取發(fā)育的相關(guān)基因（例如采取多樣本、多時(shí)間點(diǎn)的策略推斷發(fā)育基因，a、對(duì)比不同時(shí)間相同細(xì)胞類型的基因變化關(guān)系。b、挑選表征分化關(guān)系的基因進(jìn)行軌跡分析），缺點(diǎn)很明顯，難度特別大。
（4）尋找細(xì)胞類型之間具有連續(xù)變化的基因，理論上這是最優(yōu)的選擇。下圖為monocle軟件分析得到的軌跡分析基因變化圖。

圖3 軌跡分析基因表達(dá)變化

降低維度

降維方法除了在基礎(chǔ)分析篇提到的線性降維PCA與非線性降維TSNE、UMAP之外，針對(duì)軌跡分析會(huì)有獨(dú)特的降維方法。來(lái)了解一下軌跡分析軟件用到的主流降維方式。

ICA（independent component analysis，獨(dú)立成分分析）

ICA是找出構(gòu)成信號(hào)的相互獨(dú)立部分(不需要正交)，對(duì)應(yīng)高階統(tǒng)計(jì)量分析。ICA理論認(rèn)為用來(lái)觀測(cè)的混合數(shù)據(jù)陣X是由獨(dú)立元S經(jīng)過(guò)A線性加權(quán)獲得。

圖4 ICA數(shù)據(jù)解構(gòu)

類似于PCA，ICA也是找到一個(gè)特征空間，數(shù)據(jù)的處理就都需要映射到新空間中去，但是不同于PCA，ICA是將數(shù)據(jù)解構(gòu)，從混雜的信號(hào)中分離原始的多個(gè)生物信號(hào)。

圖5 ICA尋找生物學(xué)信號(hào)

ICA與PCA一樣，是一種線性降維方法，常用于評(píng)估數(shù)據(jù)的原始組成，在ICA中，這些信號(hào)被認(rèn)為是相互獨(dú)立的。

DF (Diffusion Maps)擴(kuò)散映射

Diffusion Maps是一種非線性降維的方法，如果兩個(gè)點(diǎn)的距離較近，則從一個(gè)點(diǎn)行走到另一個(gè)點(diǎn)的概率就大，反之，如果兩個(gè)點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)，則從一個(gè)點(diǎn)行走到另一個(gè)點(diǎn)的概率就小。Diffusion Maps就是將兩個(gè)點(diǎn)之間的距離轉(zhuǎn)換成他們之間能夠產(chǎn)生隨機(jī)行走的概率，并用這個(gè)隨機(jī)行走的過(guò)程去捕獲數(shù)據(jù)的“鄰居”結(jié)構(gòu)，從而將高維數(shù)據(jù)展開(kāi)，用低維表示。如下圖：

圖6 Diffusion Maps降維示意圖

反向圖嵌入（DDRTree)降維

Monocle在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維時(shí)采用DDRTree方法，這種方法會(huì)將細(xì)胞位點(diǎn)擬合到“樹”形結(jié)構(gòu)上，這種方法也最為大多數(shù)人所接受，基礎(chǔ)這種降維，衍生了PAGA^[3]，Slingshot、TSCAN等分析方法。

圖7 DDRTree分析示意圖

PHATE降維方法

PHATE降維方法1、通過(guò)局部相似性對(duì)局部數(shù)據(jù)信息進(jìn)行編碼；2、使用潛在距離編碼數(shù)據(jù)中的全局關(guān)系；3、將潛在距離信息嵌入低維以進(jìn)行可視化（先考慮局部，再縱觀全局，最后低維展示的優(yōu)化）。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于以所需的維數(shù)提供數(shù)據(jù)集的局部和全局結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確、去噪表征，而無(wú)需對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)強(qiáng)加任何強(qiáng)假設(shè)，下圖是PHATE降維示意圖。

圖8 PHATE降維示意圖

當(dāng)然，除了上述介紹的方法，還有很多其他的方式，下面是對(duì)軟件降維方法的總結(jié)：

定義軌跡