使用BRAKER2進行基因組注釋
BRAKER2是一個基因組注釋流程，能夠組合GeneMark，AUGUSTUS和轉錄組數據。
在使用軟件之前，有幾點需要注意下
- 盡量提供高質量的基因組。目前隨著三代測序價格下降，這一點問題不大。
- 基因組命名應該簡單，最好就是">contig1"或">tig000001"
- 基因組需要屏蔽重復序列
- 默認參數通常表現效果就很好，但是也要根據物種來
- 一定要對注釋結果進行檢查，別直接使用
軟件安裝
BRAKER的依賴軟件不少，且Perl需要安裝的模塊也很多，我們用conda能解決這些問題(需要添加bioconda頻道)
conda create -n braker2 braker2
安裝結束后會輸出一些提示信息，匯總以下就是
- 保證AUGUSTUS的config目錄能夠有可寫權限（自己用conda安裝不需要考慮這個問題）
- GeneMark和GenomeThreader還需要額外下載安裝
我們一定要安裝的就是GeneMark，需要從 http://exon.gatech.edu/GeneMark/license_download.cgi 下載安裝，然后添加環境變量
export GENEMARK_PATH=/your_path_to_GeneMark-ET/gmes_petap/
此外還有一些BRAKER2建議的軟件，conda沒有安裝，需要自己按需安裝
- DIAMOND 0.9.24: 替代NCBI-BLAST+
- cdbfasta 0.99: 糾正AUGUSTUS預測的開放閱讀框內內含有終止密碼子的基因
- cdbyank 0.981: 糾正AUGUSTUS預測的開放閱讀框內內含有終止密碼子的基因
- GenomeThreader: 僅在你需要用蛋白數據進行注釋時，才需要
關于這些conda未安裝的軟件參考https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER#optional-tools
以cdbfasta和cdbyank為例
git clone https://github.com/gpertea/cdbfasta.git
cd cdbfasta
make all
之后可以添加到環境變量
export CDBTOOLS_PATH=/path/to/cdbfasta/
也可以復制到conda建立的braker2的環境中，其中~/miniconda3是我conda的路徑
cp cdbfasta cdbyank perltest.pl ~/miniconda3/envs/braker2/bin
安裝完成之后，建議現運行下面這一步檢查軟件依賴
braker.pl --checkSoftware
軟件運行
BRAKER根據數據類型，有不同的運行模式，但根據現狀其實最常見的情況是測了一個基因組，并且還測了二代的轉錄組，或許還有一些近緣物種的蛋白序列。因此假設你手頭有下面這些數據
- 基因組序列: genome.fasta
- 轉錄組數據: XX_1.fq.gz, XX_2.fq.gz
- 蛋白序列: proteins.fa
第一步: 屏蔽基因組中的重復序列，這一步參考使用RepeatModeler和RepeatMasker注釋基因組重復序列
RepeatMasker -xsmall -species arabidopsis -pa 40 -e ncbi -dir . genome.fasta
#-xsmall: soft-mask
這一步輸出的genome.fasta.masked將是后續注釋的輸入
第二步: 使用STAR將FastQ比對到參考基因組，STAR使用說明參考「RNA-seq分析軟件」RNA-seq比對工具STAR學習筆記
mkdir -p STAR
# 建立索引
STAR \
--runThreadN 20 \
--runMode genomeGenerate \
--genomeDir STAR \
--genomeFastaFiles genome.fasta
# 比對
STAR \
--genomeDir STAR \
--runThreadN 20 \
--readFilesIn XX_1.fq.gz, XX_2.fq.gz \
--readFilesCommand zcat \
--outFileNamePrefix xx_ \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
--outBAMsortingThreadN 10 \
--outSAMstrandField intronMotif \
--outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical
mv xx_Aligned.sortedByCoord.out.bam xx.bam
輸入結果為 xx.bam 如果測了多個組裝的轉錄組，為每個樣本運行一次比對生成多個BAM文件。
第三步: 運行BRAKER2
braker.pl --cores 48 --species=yourSpecies --genome=genome.fasta.masked \
--softmasking --bam=xx.bam \
--prot_seq=proteins.fa --prg=exonerate \
--gff3
braker.pl最多支持48個線程。
最終會輸出蛋白序列和CDS序列以及GFF文件
可能問題
使用conda安裝時可能會出現的問題
Error in file bamToWig.py at line 172: Return code of subprocess was 127
原因是因為faToTwoBit程序出錯
faToTwoBit
faToTwoBit: error while loading shared libraries: libssl.so.1.0.0: cannot open shared object file: No such file or directory
這是因為conda沒能正確處理依賴關系，openssl版本過高，解決方法如下
# 建立軟鏈接
cd ~/miniconda3/envs/braker2/lib
ln -s libssl.so libssl.so.1.0.0
ln -s libcrypto.so libcrypto.so.1.0.0
運行時出現如下警告
OpenBLAS blas_thread_init: RLIMIT_NPROC 4096
無視掉
參考資料
- BRAKER2官方教程: https://github.com/Gaius-Augustus/BRAKER
