目前有多種方法可以進行RNA velocity的分析：
- scVelo（參考文章：單細胞轉錄組數據分析|| scVelo 教程：RNA速率分析工具）
- velocyto （官網:Welcome to velocyto.py!）
- Seurat （參考文章：用Seurat做RNA Velocity）
在前一篇的文獻學習里（RNA velocity of single cells文獻學習），作者使用的是velocyto軟件，也就是上面的第二個軟件進行分析的，所以我也主要學習這個軟件的使用。作者的詳細代碼見：here，里面有R和python兩種版本。
由于RNA velocity分析的前提，是要我們從單細胞RNA-seq的數據里區分出未成熟mRNA（unspliced）和成熟的mRNA（spliced），所以你需要從fastq文件開始，與基因組進行對比后得到sam文件，從sam文件轉成bam，再從bam文件里提取這些信息，最后你會得到.loom為后綴的文件，這個文件才是我們需要的。
你可以在這個網站(http://velocyto.org/velocyto.py/tutorial/cli.html)里學習如何從bam文件里提取我們需要的信息，你可以使用10X、SMART-seq2、dropseq等平臺測序得到的fastq文件，每一種情況都有詳細的說明。
這次練習的原始數據是GSE99933，有768個文件，這個project是應用SMART-Seq2平臺進行測序的。
懶得從fastq文件走一遍完整流程的童鞋可以直接下載bam文件：
http://pklab.med.harvard.edu/velocyto/chromaffin/bams.tar
或者你可以直接下載loom文件進行分析：
http://pklab.med.harvard.edu/velocyto/chromaffin/dat.rds
（一）fastq文件下載以及文件名的批量修改
關于如何批量下載fastq文件，如何比對，如何從sam文件轉成bam文件，我在單細胞測序實戰（第一部分）寫的非常詳細。這里一共768個fastq文件，大約是12G左右。
（其實批量修改文件名不是必要的，完全可以跳過這一步，但是不知道為什么自己突發奇想要改名，可能是看著SRR文件名不舒服吧。。。想節約時間的童鞋可以直接跳到fastqc步驟）
下載fastq文件后，文件名都是SRR開頭的，那么我想把前綴改成細胞的編號：E13.5_E之類的，應該怎么弄？首先你要先拿到細胞編號的list，在GEO頁面里：
在新頁面里，點擊“Export”:
現在你下載了所有樣品的信息，是一個csv表，用excel打開是這樣的：
用查找/替換功能把[single cell RNA-seq]替換成空白（注意是空白，不是空格）：
從這個表里提取第二列的細胞編號：
$ awk -F"," '{print $2}' sample.csv>> cell_name.txt
$ head cell_name.txt
E12.5_A1
E12.5_A2
E12.5_A3
E12.5_A4
E12.5_A5
E12.5_A6
E12.5_A7
E12.5_A8
E12.5_A9
E12.5_A10
在win10系統下批量修改文件名，看視頻：here或者windows如何批量修改文件名
修改后的fastq文件的名字就變成了：
（二）fastqc
隨便抽取幾個fastq文件看一下：
（三）比對
進入fastq文件夾里進行比對：
$ ls *.gz | while read i;do hisat2 -p 10 -x /media/yanfang/FYWD/RNA_seq/ref_genome/index/mm10/genome -U $i -S /media/yanfang/FYWD/scRNA_seq/RNA_relocity/GSE99933_sam/${i}.sam;done
這一步要過夜（大概10個小時多一點），因為是用自己的電腦跑的，所以比較慢。生成的sam文件：
（四）生成bam文件
可以先看一下后續分析要去的bam文件是什么樣的：
$ ls *.fastq.gz.sam | while read i ;do (samtools sort -O bam -@ 10 -o /media/yanfang/FYWD/scRNA_seq/RNA_relocity/GSE99933_bam/$(basename ${i} ".fastq.gz.sam").bam ${i});done
（五）下載mouse_repeat_msk.gtf
除了mm10_annotation.gtf以外(可在https://www.gencodegenes.org/下載)，我們還需要一個文件進行后續的分析，這個文件叫repeat_msk.gtf，你可以在這個網站：here下載到：
選項都填好，點擊左下角“get output”。就行了。
這個gtf文件是幫助我們去除表達的重復元素(expressed repetitive elements)，因為這些reads可能在下游分析中構成一個混淆因素。
到此，生成loom文件的必需文件就都準備齊全了。下一篇會介紹生成loom文件需要哪些軟件。
