? ? 按照實驗需求，質粒構建分為克隆質粒，表達質粒，基因敲除質粒，報告質粒，病毒質粒，基因組工程質粒等。
? ? 這部分以pEGF-N1為backbone，human p53 coding sequence 為插入序列，用傳統的雙酶(EcoR I和BamH I)切重組質粒的方法，介紹質粒元件和snapgene的基本操作流程。
1. Snapgene 打開pEGF-N1
? ? SnapGene打開新文件的方式有兩種，一種是找到質粒的全部序列，復制粘貼或者直接將質粒序列TXT文檔拖拽到snapgene，snapgene會自動識別，即可打開質粒圖譜；另外一種是輸入，NCBI序列，addgene序列，snapgene在線序列，輸入想要查找的質粒名稱/編號，即可在線加載出來質粒。全面的是打開snapgene彈出的界面，后面的是通過工具欄打開新文件。
? ? 收藏的工具是將多個質粒全部放在一個收藏夾中，相當于照片放在相冊里，打開一個收藏夾就是你自己保存的質粒組，方便進行質粒的管理，但是這個功能sanpgene viewer沒有。
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2. pEGF-N1
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? ? ? ? 大部分元件如復制起點，抗性基因，蛋白標簽等在前面已經介紹過了，還有模糊的可以翻回去看看，這里補充一下終止子。
? ? ? ? 終止子：顧名思義就是終止mRNA轉錄的因子，界定了一個轉錄單元的結束，位于基因下游，通常緊跟著polyA(聚腺苷酸：多個腺苷酸(A)，在真核中ployA能延長轉錄本的壽命，保持穩定；原核生物中加快轉錄本的講解)。
? ? ? ? 原核的轉錄子分為兩類：一類是依賴 ρ因子(Rho)，一類是不依賴的。ρ因子是一種解旋酶，能夠輔助RNA聚合酶轉錄終止，此系統在質粒中比較少見；在細胞表達質粒中常見的是非ρ因子依賴的終止子。非依賴性ρ因子是一種固有強終止子，即富含GC的回文結構，富含氫鍵。下圖為非典型ρ因子終止子示意圖。幾乎所有常用細胞表達質粒都是非ρ因子終止子，包括T7，rrnB等。
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? ? 真核的轉錄在啟動子的時候講過按照核酶分為三類，核酶I，II，和III。每種核酶終止方式不同，核酶I用來轉錄rRNA，依賴ρ因子類似原核；核酶II轉錄mRNA和miRNA，依賴ρ因子和RNA酶相關蛋白參與招募剪切和加polyA；聚合酶III轉錄tRNA和smRNA，依賴特定RNA二級結構和特定序列。
? ? 哺乳動物細胞表達質粒常用于轉錄mRNA，常用終止子有SV40，hGH，BGH和rbGlob等，polyA信號序列同終止序列是同意的。
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? ? 如上圖所示，在polyA與富含GU之間協同進行切割，釋放mRNA和核酶，polyA尾在mRNA核外轉運和翻譯過程中起維持mRNA穩定、避免其被降解的重要作用。但是在病毒載體中，polyA與包裝系統連用，會降低病毒滴度，延長轉錄本的壽命，所以使用較弱的終止信號。
3. Human p53 設計引物
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? ? 在NCBI中搜索human p53，找到相對應的mRNA序列，搜索找到CDS區域，如圖中深色部分，然后復制粘貼到snapgene中，用來構建引物。
? ? 將human p53的CDS 按照前面添加DNA文件的方法，在snapgene中打開，選擇BamHI酶和EcoRI酶進行酶切，引物設計需要添加酶切位點和保護堿基。
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? ? 按照自己需要，命名完整準確，酶切問點可以在snapgene中選擇添加，保護堿基可以百度查看。
? ? 使用snapgene模擬功能，能夠看到PCR反應產物，有兩個酶切位點存在，將擴增產物保存好。
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4. 克隆
? ? 在snapgene中有模擬克隆的功能，能夠將雙酶切克隆的結果可視化，讓自己做到心中有數。行動--限制和插入片段克隆--插入片段。
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? ? 選擇好各自的酶切位點，即可看到自己設計的質粒。這部分主要以雙酶切重組質粒為基礎，快速熟悉snapgene的簡單引物設計，PCR反應，插入片段克隆以及補充的終止子等，希望能有所幫助。
